[发明专利]RNA的分析方法

说明书

技术领域

本发明涉及从被固定液固定了的组织或细胞中提取出的RNA的分析方法。

背景技术

近年来，对在医院、研究机构等保存有大量样本的、以福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织为代表那样的、被固定液固定了的组织、细胞的基因的分析技术的期待大幅提高。特别是对于FFPE组织，由于积累了过去的大量病患数据，因而如果确立能够从FFPE组织提取基因、分析它们的表达的技术，则能够进行使用长期保存后的组织的可追溯研究，可以对将来的病患的治疗和/或预防做出巨大贡献。

然而，认为从FFPE等固定组织、固定细胞中提取出的RNA在一般的固定条件、保管条件下进行分解、片段化，因此难以进行基因表达分析。另外，由于作为固定液最常用的甲醛(福尔马林)，有时RNA-RNA间、RNA-蛋白质间发生交联、和/或甲醛被添加/修饰到RNA上，RNA在这样的状态下难以进行酶反应和/或化学反应，基因表达分析变得困难。因此，要求由进行了分解、片段化的RNA样品、和/或被交联、添加/修饰了的RNA样品进行基因表达分析的技术。另外，在进行这样的RNA样品的基因表达分析时，在分析之前确认RNA样品的分解、片段化、或者交联和/或添加/修饰的程度来判断品质、确认可否分析，对于进行正确的基因表达分析以及miRNA表达分析是非常有用的，要求能够进行这些确认的技术。

专利文献1～4中公开了关于扩增分解了的RNA来进行基因表达分析的方法的技术。

专利文献1提供与扩增靶多核苷酸、产生其大量拷贝相关的方法、组合物和试剂盒。1次扩增反应中的mRNA的扩增倍数标准达50～100或250倍，或者为500～1000倍或500～2000倍以上，从不足纳克量的总RNA获得尽可能多的扩增RNA。然而，如果使用这样从少量的RNA尽可能多地扩增来分析的方法，则基因的每个扩增倍率产生偏差的所谓扩增偏倚变大，因而可以说不能正确地分析基因的表达量。

专利文献2涉及为了全基因表达谱分析而使用例如保管的固定化石蜡包埋组织材料等片段化RNA等的方法，提供即使是非常小的、或极度片段化的RNA试样，也能够完全扩增的试样的调制方法。然而，该方法包含将被片段化的RNA进行多聚腺苷酸化的工序，认为该工序中的反应的偏差作为结果可能严重影响基因表达谱。另外在专利文献2中，公开了新的线性RNA扩增法。通过合成5’末端具有锚定序列、且3’末端具有RNA聚合酶启动子序列的双链cRNA，由该cDNA依赖上述RNA聚合酶启动子序列合成cRNA，由该cRNA通过引发上述锚定序列而再次合成cDNA的方法，来扩增从利用激光捕获显微切割、细胞分选仪获得的少量的细胞和/或组织中得到的微量的RNA，从而抑制作为现有的扩增法的问题的、在每次重复cDNA合成-cRNA合成循环时产生的cDNA和cRNA上的mRNA5’相当区的缺失。

专利文献1、专利文献2均作为无扩增偏倚的方法记载，认为每1个循环的偏倚与以往相比较小，但由于着眼于由少量的RNA尽可能多地扩增，因而作为扩增倍率相当大。因此，相应地偏倚积累，不可否认结果产生大的扩增偏倚。

专利文献3涉及为了全基因表达谱分析而使用例如保管的固定化石蜡包埋组织材料等片段化RNA等的方法，提供即使是非常小的、或极度片段化的RNA试样也能够完全扩增的试样的调制方法。然而，该方法包含将被片段化的RNA进行多聚腺苷酸化的工序，认为该工序中的反应的偏差作为结果可能严重影响基因表达谱。

专利文献4公开了包含例如分解度等核酸样品中的核酸的品质测定方法的、分解核酸样品中的靶标的扩增用组合物和方法，以及用于从分解RNA样品制成基因表达谱的方法。以来源于同一基因的不同尺寸的扩增子(扩增产物)的扩增效率为标准，随着样品分解，尺寸较大的扩增子的扩增效率降低，由此来评价品质。本方法对于十几种至二十几种基因分别进行多个尺寸的PCR。认为在RNA分解进行的情况下，PCR的探针尺寸越大则越不被扩增，因而可以一定程度确认分解度，但需要对每个RNA样品PCR扩增总共数十种基因，因此认为本方式难以实际进行。