[发明专利]二硫键连接的二聚体蛋白质在丝状噬菌体上的展示

权利要求书

1.一种用于在丝状噬菌体颗粒的表面上展示功能性的、多聚体的、链间二硫键连接的蛋白质的可复制噬菌体载体；包含与编码源于外源蛋白的第一氨基酸序列的多核苷酸序列融合的编码噬菌体pIX或pVII蛋白的核酸序列，其中所述编码的外源蛋白氨基酸序列包含至少一个半胱氨酸残基，所述半胱氨酸残基能与表达为与pIX或pVII形成的外源蛋白融合物的第二多肽链上的半胱氨酸残基氧化性键合，其中所述第二氨基酸序列与所述第一氨基酸序列相同或为所述第一氨基酸序列的变体，或者为不同的蛋白质；并且从而如此形成的半胱氨酸键为在同一丝状噬菌体颗粒的表面上展示的功能性多聚体结构的链间二硫键。

2.根据权利要求1所述的噬菌体载体，其中所述蛋白质结构的功能活性选自蛋白A结合和FcRn结合。

3.根据权利要求1所述的噬菌体载体，其中所述编码的氨基酸序列包含选自SEQ ID NO：1-3和4的抗体铰链结构域，以及SEQ ID NO：1-3和4的核心残基。

4.根据权利要求3所述的噬菌体载体，其中所述链间二硫键处于所述抗体铰链结构域氨基酸序列或核心铰链残基内。

5.根据权利要求4所述的噬菌体载体，所述噬菌体载体还包含选自SEQ ID NO：5-16和17-22的序列或它其中至少一个残基被置换的变体。

6.根据权利要求1所述的噬菌体载体，其中所述核酸还编码与所述外源蛋白编码序列中的一者有效融合的细菌分泌信号。

7.根据权利要求6所述的噬菌体载体，其中所述细菌分泌信号选自如SEQ ID NO：14中所示的pelB序列或变体pelB序列，或者为SEQ ID NO：15中所示的ompA或ompA的变体。

8.根据权利要求1所述的噬菌体载体，所述噬菌体载体还包含诱导型启动子。

9.根据权利要求8所述的噬菌体载体，其中所述诱导型启动子为lac启动子或lac的突变体。

10.一种包封有编码融合多肽的载体并且在表面上具有功能性的、多聚体的、链间二硫键连接的蛋白质的丝状噬菌体颗粒；其中所述蛋白质包含与丝状噬菌体pVII或pIX蛋白的氨基末端融合的具有半胱氨酸残基的第一外源多肽，因此当所述蛋白质在丝状噬菌体蛋白质的表面表达时，所述半胱氨酸残基与融合至pIX或pVII的第二多肽链上的半胱氨酸残基氧化性键合，其中所述第二氨基酸序列与所述第一氨基酸序列相同或为所述第一氨基酸序列的变体，或者为不同的蛋白质；并且从而如此形成的半胱氨酸键为在同一丝状噬菌体颗粒的表面上展示的功能性多聚体结构的链间二硫键。

11.根据权利要求10所述的丝状噬菌体颗粒，其中所述蛋白质结构的功能活性选自蛋白A结合和FcRn结合。

12.一种细菌宿主细胞，所述宿主细胞包含根据权利要求10所述的丝状噬菌体。

13.根据权利要求12所述的宿主细胞，其中所述功能性蛋白质能够从所述原核宿主细胞的培养基回收。

14.根据权利要求13所述的宿主细胞，其中所述蛋白质在丝状噬菌体颗粒的表面上展示。

15.一种由根据权利要求12所述的细菌宿主细胞表达的二聚体或多聚体融合蛋白，所述融合蛋白具有可测量的功能蛋白结合活性。

16.根据权利要求15所述的融合蛋白，其中所述可测量的蛋白结合活性为蛋白A结合或FcRn受体结合。

17.根据权利要求16所述的多聚体蛋白结构的生物活性外源蛋白变体。

18.一种包含根据权利要求4所述的核酸噬菌体载体的细菌宿主细胞的噬菌体文库，其中所述载体内编码所述抗体序列内的各个分立残基或结构域的特定位置进行了多样化。

19.根据权利要求18所述的噬菌体文库，其中所述核酸编码具有氨基酸置换的形成Fc的序列。

20.根据权利要求19所述的噬菌体文库，其中所述形成Fc的序列还包含配体结合结构域。

21.根据权利要求20所述的噬菌体文库，其中所述配体结合结构域选自受体结合配体、受体胞外结构域、包含可变结构域和恒定结构域的抗体Fab结构域以及单链Fv构建体。