[发明专利]梭菌神经毒素的定量检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及参照参考样品中梭菌毒素的已知浓度，用于体外确定样品中梭菌神经毒素的未知浓度的方法。该方法可包括电刺激与所述样品接触过的肌肉组织，比较各自对所述肌肉组织诱导的效果，从而确定所述未知浓度。该方法也可用于评价样品中梭菌神经毒素相对于参考标准的相对效价。

背景技术

近年来，肉毒神经毒素已经成为治疗局部肌张力异常和痉挛适应症的标准制剂。药物制剂可市售获得，例如易普森公司(Ipsen Ltd.)或爱力根公司(Allergan Inc.)不含其它任何梭菌蛋白的高纯度神经毒素可从例如梅尔茨制药(Merz Pharmaceuticals)获得。另一种制剂由Solstice Neurosciences公司注册。还有另一种制剂由Mentor公司注册。这些制剂在所使用的肉毒毒素类型或生物效力和效价各方面均不同。

对患者的治疗通常是将神经毒素注射到受侵袭的肌肉组织，使制剂位于神经肌肉终板附近，即靠近细胞受体，介导其吸收进入到控制所述受侵袭肌肉的神经细胞。已观察了神经毒素扩散的各种不同程度。这种扩散可以认为是与注射量和注射的特定神经毒素制剂有关。由于扩散，可在附近的肌肉组织观察到因乙酰胆碱释放抑制引起的系统性副作用。通过将注射剂量减少到治疗相关的水平，可很大程度上避免未治疗肌肉的意外麻痹事件。超剂量也会给患者的免疫系统带来问题，因为注射的神经毒素会导致形成中和抗体。如果发生这种情况，毒素会失活，不能缓解不随意肌的活动力。

在已确定效价的制剂如可售产品或生产过程中生产的批次中，剂量当量或变化的差异会通过可能的副作用和免疫力的进展增加患者的风险。因此，尽可能精确地确定包含在所述市售产品或批次产品(即没有明显差异)中梭菌神经毒素的浓度是至关重要的，以便将毒素浓度调整至对患者有益的可靠有效剂量。这可以激励生产者针对不同治疗目的提供使生物活性即效价得到最佳开发的制剂。

EP 1 597 584 B1提供了用于体外确定样品如含有肉毒神经毒素的样品中突触前神经肌肉阻滞物质的量的方法。该方法包括在含有突触前神经肌肉阻滞物质的样品存在下，电刺激肌肉组织，优选小鼠的肋骨肌肉，比较该样品诱导的效果和参考物质诱导的效果，从而确定样品中突触前神经肌肉阻滞物质的量。

GB 2 416 849 A和GB 2 398 636 A提供了用于体外确定样品如含有肉毒神经毒素的样品中突触前神经肌肉阻滞物质的量的方法。该方法包括在含有突触前神经肌肉阻滞物质的样品存在下，电刺激平滑肌肉组织，优选小鼠或大鼠的肋骨肌肉，比较该样品诱导的效果和参考物质诱导的效果，从而确定样品中突触前神经肌肉阻滞物质的量。

US 2003/0032891 A1提供了体内测量物质如梭菌毒素效价的方法，其中将所述物质施用于哺乳动物，使哺乳动物受到刺激并且监测所述哺乳动物对所述刺激产生的耳廓反射响应。

EP 2 015 065 A1提供了定量神经毒素如梭菌神经毒素效力的方法，其中将所述毒素施用于非人类哺乳动物的后腿，对所述非人类哺乳动物施加电刺激，测量所述后腿的收缩并与其它后腿的收缩进行对比。

Pearce等，Toxicon，Vol.35，No.9，pp.1373-1412，1997，公开了大鼠/小鼠膈神经偏侧膈结合肉毒神经毒素的适宜性。

Wohlfahrt等，Naunyn-Schmiedeberg’s Arch Pharmacol 355，335-340(1997)采用小鼠横膈膜通过剂量依赖响应曲线比较了两种市售肉毒毒素A制剂的效力。

Chang等，Naunyn-Schmiedeberg’s Arch.Pharmacol.282，129-142(1974)比较了A型肉毒毒素和β-环蛇毒素对分离的神经-肌肉标本如小鼠和大鼠横膈膜的突触前行为。

Sheridan等，J.Appl.Toxicol.19，S29-S33(1999)描述了基于传统的毒素浓度生物检测法确定肉毒菌拮抗剂的效力。

James等，Am.J.Physiol.Gastrointest.Liver Physiol.285，G291-G297(2003)描述了肉毒毒素对幽门和窦平滑肌的抑制效果。

等，Exp.Neurol.，vol.147，1，1997描述了与含有已知量毒素的样品的效价相比，用于确定样品中肉毒毒素相对效价的浓度响应曲线。进行了不同肉毒毒素制剂对小鼠偏侧膈的试验。

然而，上述引用的现有技术的定量方法缺少管理机构认证要求的精确性。因此，那些公开的方法不能用于管理目的，而是需要进行不合时宜的小鼠杀死试验。

发明目的