[发明专利]用于测定未加工和部分加工的A型神经毒素的系统

说明书

本发明涉及在神经毒素生产过程中用于质量控制和安全性的工具。特别地，其涉及用于测定在包含加工的和部分加工的和/或未加工的BoNT/A的溶液中的部分加工的和/或未加工的神经毒素A多肽(BoNT/A)的量的方法，所述方法包括步骤：在允许所述抗体与所述部分加工和未加工的BoNT/A结合的条件下，将所述溶液的样品与特异性结合部分加工和未加工的BoNT/A的捕获抗体接触，从而形成复合物，并确定形成的复合物的量，而复合物的量指示了所述溶液中的部分加工和/或未加工的BoNT/A的量。此外，本发明考虑了用于实施所述方法的装置和试剂盒。

肉毒梭菌(Clostridium botulinum)和破伤风梭菌(Clostridium tetani)生产强力的神经毒素，分别是肉毒梭菌毒素(BoNT)和破伤风毒素(TeNT)。这些梭菌神经毒素特异性结合神经元细胞并且破坏神经递质释放。每种毒素都作为无活性的未加工的约150kDa的单链蛋白质合成。翻译后加工涉及二硫键的形成和细菌蛋白酶的有限的蛋白水解作用(切割)。活性神经毒素由两条链组成，约50kDa的N端轻链和约100kDa的C端重链，两链通过二硫键连接。神经毒素结构上和功能上由3个结构域组成，即，催化轻链、涵盖了易位结构域的重链的N端一半和含有单或多受体结合位点的重链的C端一半，参见Krieglstein 1990，Eur J Biochem 188，39；Krieglstein 1991，Eur J Biochem 202，41；Krieglstein 1994，J Protein Chem 13，49。肉毒梭菌神经毒素是作为分子复合物合成的，所述复合物包含150kDa神经毒素蛋白和相关联的无毒复合蛋白。复合物大小随梭菌菌株而不同，而不同的神经毒素血清型范围从300kDa，至500kDa以上，至多达900kDa。这些复合物中的无毒复合物蛋白使神经毒素稳定，并保护其免受降解，参见Silberstein 2004，Pain Practice 4，S19-S26。

肉毒梭菌分泌命名为A至G的7种抗原性不同的神经毒素血清型。所有的血清型与由破伤风梭菌分泌的相关TeNT都是Zn²⁺-内切蛋白酶，其通过切割SNARE蛋白阻断突触的胞外分泌，参见Couesnon，2006，Microbiology，152，759。CNT导致在肉毒中毒和破伤风中所见的弛缓性肌肉麻痹，参见Fischer 2007，PNAS 104，10447。

不论其毒性效应，肉毒梭菌毒素复合物已在多种疾病中被用作治疗剂。肉毒梭菌毒素A血清型(BoNT/A)于1989年在美国被批准用于人用途，用于治疗斜视、睑痉挛和其他病症，因而具有特别重要的意义。它作为BoNT/A蛋白制备物是可商购的，例如商标名BOTOX(Allergan Inc)或商标名DYSPORT(Ipsen Ltd)。不含复合蛋白质的改良的BoNT/A制备物是可商购的，商标名为XEOMIN(Merz Pharmaceuticals GmbH)。出于治疗应用，将制备物直接注射入待治疗的肌肉中。在生理pH下，毒素从蛋白质复合物中释放并且产生所需的药理学作用。肉毒梭菌毒素的效应只是暂时的，这是为何维持治疗效果需要重复施用肉毒梭菌毒素的原因。

梭菌神经毒素弱化肌肉收缩并且是斜视、局限性肌张力障碍(包括颈肌张力障碍和良性自发性睑痉挛)的有效疗法。其还表现出缓解偏侧面肌痉挛和局部痉挛，并且对广泛的其他适应证有效，例如胃肠道病症、多汗症和美容皱纹校正，见Jost 2007，Drugs 67，669。

在生产梭菌神经毒素的过程中，活性神经毒素多肽的定性和定量测定以及质量控制是特别重要的。目前可获得的神经毒素制备物除所需的活性(加工的或成熟的)神经毒素以外，还包含不同量的未蛋白水解加工的前体和/或部分加工的神经毒素多肽。未蛋白水解加工的前体或部分加工的神经毒素多肽仅在少数氨基酸上不同于成熟的(活性的、加工的)神经毒素多肽。因此，难以基于它们的化学和物理性质定量地区分它们。另一方面，总蛋白质含量中的未蛋白水解加工的前体和/或部分加工的神经毒素多肽的部分在此类制备物中可能仍然是显著的，即，与制备物的比活相关。