[发明专利]用于生物性结合的特性描述的方法

说明书

技术领域

本发明涉及利用光学渐逝场进行对与支撑物的表面结合的光散射标记(label)的强度测量的领域。

背景技术

全内反射(“TIR”)或者全内反射显微镜方法(“TIRM”)在现有技术中是众所周知的。如果光以低于临界角(的角度)撞击第一介质和第二介质之间的界面，并且后者具有比前者更小的折射率，那么该光在第一介质之内被全反射。在这些情况下，生成了电磁场，即“渐逝场”。渐逝场穿透到光疏介质中。渐逝场的能量根据与界面的距离指数性地消散。参数“穿透深度”被定义为渐逝场的能量下降至其在界面处能量值的l/e倍时所处的位置与界面的距离。

光学渐逝场允许对穿透深度之内的对象进行光学检测。穿透深度是100nm的量级，其值取决于入射的角度、光的波长以及第一和第二介质的折射率。

用于在渐逝场之内检测对象的已知方法是使用能够被该场激发的荧光性对象。测量被激发对象的荧光。

光散射对象也可以被用作检测对象。在渐逝场之内，这些对象散射由渐逝场生成的光。可以利用照相机来监测该散射光。美国专利No.5599668公开了一种用于实时测量在包括DNA阵列的支撑物的多个捕获位点上的光散射标记、即可检测对象的结合或融合的方法。根据这种方法，在光学渐逝场的深度之内测量在这样的标记上被散射的光的强度。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于生物性结合的特性描述的方法。本发明的进一步目的在于提供这种方法的应用。

这一目的通过包括如下步骤的方法来实现：

a)提供测定物，所述测定物包括通过至少一种结合与支撑物的表面结合的至少一个光散射标记；

b)在所述标记与所述表面结合的同时，测量光学渐逝场中的所述标记的随时间的散射光强度的波动。

结合特性例如是结合的长度、结合的柔性以及结合的活动性。在所述标记与所述表面结合的同时测量散射光强度随时间的波动，并分析所测量的强度值，允许对所述参数，以及因此对结合的类型，得出结论。根据本发明的方法允许识别不同的结合和/或区分不同的结合。

在本发明的一个应用中，所述方法用于区分特异性结合和非特异性结合。

在本发明的另一应用中，所述方法用于区分通过单一结合与支撑物的表面结合的标记和通过多个结合与支撑物的表面结合的标记。

两种应用都能够有利地用于生物传感器，其中，测定物中的非特异性结合和/或多个结合通常限制了该生物传感器的灵敏度。根据本发明的方法允许区分特异性结合、非特异性结合和多个结合，这允许改善该生物传感器的灵敏度。

此外，该方法能够用于区分两个不同的特异性结合和/或用于测量至少一个结合的结合长度和/或结合柔性。

优选的是用于测量该标记的随时间的散射强度的时间帧为≥1秒，优选≥20秒。这种时间帧允许该标记处于在其布置(尤其是其相对于支撑物的表面的最小高度和最大高度)处的几乎所有位置。

此外，优选的是利用≤40ms，优选≤1ms的曝光时间来完成每个强度测量。这种曝光时间允许测量标记的精确位置而不是归因于该曝光时间之内的移动的平均位置。

根据本发明的优选实施例，空间分辨地测量散射光强度以说明标记在支撑物的表面的平面内的不同xy位置。对散射强度随时间的空间分辨地测量给出了能够用于描述结合的特性的额外信息。≤75nm，优选≤15nm的空间分辨率是优选的。

根据本发明的另一优选实施例，在步骤b)中，至少一个标记被暂时地朝向表面拉动和/或远离所述表面拉动和/或拉向与所述表面平行的不同方向。将该标记拉向不同方向并在这些条件下测量散射强度能够给出关于结合的进一步信息。如果标记是例如磁性的，则能够利用磁体来实现将该标记拉向不同的方向。其他类型的致动也是可能的。

根据本发明的另一优选实施例，该标记可以是均匀的或者非均匀的颗粒。

归因于其非均匀性，非均匀标记能够导致进一步的强度波动，例如当结合的颗粒倾斜或者绕其中心旋转时。因此，在非均匀标记的情况下，不仅高度而且其他参数都影响强度。影响的程度还取决于结合的类型。这种依赖关系能够用于获得进一步的信息，并且因此，提高了检测灵敏度。此外，对于非均匀标记，还能够使用外部力将标记拉向不同的方向以获得关于结合的进一步信息。

根据本发明的另一优选实施例，通过确定时间帧中的最大和最小强度之间的比率、通过确定所测量的强度值的标准偏差、通过做出所测量的强度值的柱状图并分析其形状、和/或通过分析平均扩散系数或者傅里叶分析的功率谱来确定结合的结合的活动性。

根据优选实施例，所述结合包括一个或多个生物分子。