[发明专利]使用大颗粒标记的高灵敏性免疫测定

说明书

技术领域

本发明涉及使用一种大颗粒标记的高灵敏性免疫测定。

背景技术

免疫测定广泛用于健康护理和其他领域以确定诸如蛋白、激素、DNA、RNA或酶的特定分子的存在与否。

一种用于测定体液中的特异性靶标(抗原)浓度的公知方法是所谓的“酶联免疫测定”(ELISA)。其中将来自样品的分析物固定于固体支持物上，然后向该固体支持物加入特异于所述分析物的抗体，从而其可以结合所述分析物。所述抗体连接至酶。然后向所述固体支持物加入可以被酶转化以产生诸如荧光团的可检测部分的基底。洗涤步骤后，固体基底经过使得可以对可检测部分进行检测的处理，例如在荧光读取器上进行处理。由此，这可以确定所述样品中是否存在所述分析物。

夹心免疫测定包括两种抗体，其结合抗原上不同且不重叠的表位。第一抗体(捕获抗体)接合至固体支持物，然后加入包含抗原的样品以允许形成抗原与捕获抗体之间的复合物。通过洗涤步骤除去未结合的分子，然后加入标记的第二抗体(检测抗体)，并允许其结合抗原与捕获抗体的复合物，由此形成“夹心”。进行洗涤步骤以除去未结合的检测抗体之后，通过测量标记的检测抗体的量来测定靶分子的量。使用许多标记技术，包括荧光、化学发光、放射性或磁性标记。

在大部分情况下，使用识别靶标的不同位点的两种单克隆抗体。在另一变体中，使用单克隆捕获抗体和针对抗原上不同表位的亲和力纯化的多克隆检测抗体。

在健康护理中，测量许多不同分子以诊断或监测疾病。例如，测量血糖含量以监测糖尿病。葡萄糖是以较高浓度存在于血液中的分子，其浓度为每mL约几百μg至约1mg，对应于每mL约3至6毫摩尔的浓度。测量装置以手持装置的形式提供，包括测试带。

相比之下，其他分子，如用于监测心力衰竭的生物标记NT-proBNP则以明显较低的浓度存在于血液中。在健康个体中，NT-proBNP在血液中的浓度为约20pg-150pg/mL，对应于约24-176皮摩尔/mL。高于500pg/mL的值通常视为是急性充血性心力衰竭(CHF)的指征。

目前，测量极低浓度的生物标记以诊断疾病(例如心血管疾病)要求实验室分析、大样品体积以及15分钟至数小时的时间结果(time-to-result)延滞。尽管这些测试是小型台面测试，但是较长的运行时间和大样品体积使得它们不适合于更高要求的情况，例如医院急诊部门、诊室和救护车，其中要求小样品体积、易于使用、快速以及高灵敏度。

定义

本文所用的术语“抗体”指任何同种型(IgA、IgD、IgE、IgG、IgM)的多克隆和/或单克隆抗体或其抗原结合部分，包括但不限于F(ab)和Fv片段、单链抗体、嵌合抗体和人源化抗体。

本文所用的术语“分析物”指要确定其浓度或存在的任何分子。靶分子的实例为分子靶标，例如肽、蛋白、激素、DNA、RNA和酶。术语“分析物”和“靶标”在本申请中可互换使用。

本文所用的术语“同源”指肽或蛋白与所述肽或蛋白基本上相似。术语“基本上相似”为本领域技术人员所公知。特别地，变体可以是与人群体中最优势的肽同种型的氨基酸序列相比表现出氨基酸交换的同种型或等位基因。优选地，这样的基本上相似的肽与所述肽最优势的同种型的序列相似性为至少70％，优选至少80％、85％、90％、95％、97％、98或99％。基本上相似还指降解产物，如蛋白水解降解产物，其仍然被诸如抗体的结合部分或被针对各自的全长肽的配体所识别。术语“变体”还指剪接变体。

本文所用的术语“固体基底”指对相同表位不具有特异性的捕获部分所结合的基底。术语“固体基底”和“固体支持物”在本申请中可互换使用。

本文所用的术语“结合部分”分别指表位特异性检测部分或者对相同表位不具有特异性的捕获部分。

本文所用的术语“表位特异性检测部分”指结合诸如分析物蛋白的给定靶标的一个相同表位的至少一个部分。

这样的表位特异性检测部分例如单克隆抗体、表位特异性适体、表位特异性anticalin、表位特异性凝集素、表位特异性亲和体(affibody)、表位特异性化学配体或表位特异性肽。术语“表位特异性检测部分”和检测部分在本申请中可互换使用。

本文所用的术语“对相同表位不具有特异性的捕获部分”指结合给定靶标的不同表位，或者结合给定靶标的相同表位的不同亚区的至少两个部分的集合。一个部分结合给定靶标的表位的氨基酸1-10，而结合相同表位的氨基酸2-11的第二部分的两个部分因而充当本发明表述中“对相同表位不具有特异性的捕获部分”。