[发明专利]对循环肿瘤细胞进行分类的方法

说明书

发明背景

发明领域

本发明总体涉及医学诊断，更具体涉及循环肿瘤细胞的分类。

背景信息

循环肿瘤细胞(CTC)通常是——虽然不是总是——进入不同类型癌症患者血流的浓度非常低的源自实体肿瘤的上皮细胞。已存在的肿瘤转移或释放CTC通常导致继发性肿瘤形成。继发性肿瘤一般检测不到，并且占全部癌症死亡的90％。循环肿瘤细胞提供原发性与转移性肿瘤之间的联系。这产生将循环肿瘤细胞的鉴定和表征用于转移性上皮恶性肿瘤的早期检测和治疗控制的前景。癌症患者的CTC检测提供早期诊断原发性或继发性癌症生长和确定进行癌症治疗的癌症患者的预后的有效工具，因为这些患者血液中存在的CTC的数量和特征与整体预后和对治疗的反应相关联。因此，CTC在临床症状出现前充当肿瘤扩大或转移的早期指示物。

虽然循环肿瘤细胞(CTC)的检测在癌症的控制和治疗中具有重要的预后意义和潜在治疗意义，但由于其在血液流中的隐匿性质，这些微量的细胞不容易被检测到。CTC首次被描述是在19世纪，然而只是最近的技术进步允许其可靠检测。CTC被认为以超低浓度存在于肿瘤患者的外周血液中。例如，对于癌(carcinomas)患者，据估计每一千万正常血液细胞中有一个是CTC。

CTC计数/表征的标准方法是靶向表面蛋白EpCam的免疫磁性富集法、光纤阵列扫描技术和“CTC芯片”分析。

免疫磁性富集技术依赖于利用铁磁流体进行的肿瘤细胞群免疫磁性富集，该铁磁流体连接于结合上皮细胞粘着分子(EpCAM)的抗体，该上皮细胞粘着分子仅在上皮衍生细胞上表达。

在进行光纤阵列扫描技术(FAST)以检测CTC中，将红细胞溶解，并且将有核细胞在可容纳多达3千万个细胞的载玻片上分布为单层。该方法中无富集步骤。将细胞固定，透化处理，并用全(pan)抗细胞角蛋白抗体-Alexa Fluor 555、CD45-Alexa Fluor 647和DAPI(核染色)进行染色。FAST扫描各载玻片，并确定各红色荧光物在载玻片上的位置。各荧光物通过自动数字显微镜成像，并且CTC作为CK+、CD45-、DAPI+细胞被计数。

CTC计数/表征的另一种方法是微流体或“CTC-芯片”技术。在这种方法中，全血流经78,000个EpCam涂覆的微柱。EpCam+细胞粘附至该柱，随后用细胞角蛋白、CD45和DAPI染色。

利用上皮特异性标记如细胞角蛋白和EpCAM和/或组织特异性标记如PSA、PSMA、CDX2和TTF-1鉴定CTC的分析已在本领域中被述及。暴露(revealing)和检测CTC的分析也已被述及在例如2009年9月3日提交的美国序号12/553,733中，在此引入作为参考。暴露样品中的CTC包括去除、降解或改变聚集或物理结合于循环肿瘤细胞表面的蛋白质、碳水化合物、细胞或其组合以显露细胞，从而暴露循环肿瘤细胞。暴露细胞可包括去除、降解或改变血浆蛋白、碳水化合物、血小板、其他血细胞或其组合。一般，血浆蛋白是凝血因子，如纤维蛋白。为显露细胞，可以对细胞进行酶(例如，酶介导的生化反应)处理、机械(例如，机械力)处理、电(例如，电力)处理、电磁(例如，电磁波谱的电磁辐射)处理、化学处理或其任意组合。暴露的细胞可通过图像分析和/或细胞表面标记的检测被进一步分析。

在癌症领域中，暴露、分离、检测、鉴定和富集循环肿瘤细胞(CTC)的方法一直在发展。但是，随着作出改进，需要利用越来越大量集合在一起的CTC信息的改进分析方法。因此，用于临床、研究和发展定位(development settings)的改进的有临床意义的CTC分析方法以及癌症治疗的创新方法是有必要的。

发明概述

本发明提供利用多种细胞标记和暴露或非暴露分析对CTC进行分类的方法，其为癌症患者的临床分期和治疗决策制定提供有益见解。

因此，一方面，本发明提供对来自对象的循环肿瘤细胞(CTC)进行分类的方法。该方法包括：a)提供来自对象的第一和第二样品；b)暴露第一样品中的CTC；c)利用对第一细胞标记特异的试剂分析第一样品中暴露的CTC；d)利用对第一或第二细胞标记特异的试剂分析第二样品中的CTC，其中第二样品的CTC在分析前没有被暴露或显露；和e)比较c)和d)的结果以提供来自对象的CTC分类，从而对CTC进行分类。该方法可进一步包括将e)的结果与来自对象的CTC之前分类或与已知分类进行比较。