[发明专利]基因序列分析的方法和试剂

说明书

技术领域

本发明涉及核酸分析和基因的碱基序列分析的方法，具体涉及基因序列分析、基因多型分析、基因变异分析和基因表达分析的方法。

背景技术

在DNA的碱基序列的确定中，使用凝胶电泳和荧光检测的方法被广泛应用。在该方法中，首先制备许多想要进行序列分析的DNA片段的拷贝。以DNA的5′末端作为起点制备各种长度的荧光标记片段。此外，预先加入根据这些DNA片段的3′末端的碱基种类而波长不同的荧光标记。通过凝胶电泳识别1个碱基差异的长度差，检测每个片段组产生的发光。由发光波长颜色而获知测定中的DNA片段组的DNA末端碱基种类。由于DNA从短的片段组开始依次通过荧光检测部，所以可以通过测量荧光颜色而自短的DNA开始依次获知末端碱基种类。由此进行序列确定。这样的荧光式DNA序列测定仪正在广泛地普及，另外，在人类基因组的分析中也非常活跃。在该方法中，公开了使用许多根内径50μm左右的玻璃细管，进一步利用末端检测等方法，增加每台的分析处理数的技术。

另一方面，利用以焦磷酸测序法为代表的分步的化学反应的序列确定法(例如专利文献1和非专利文献2)，由于处理的简便性而受到关注。图13(1)是表示其工序的例子。概要如下。使引物杂交至作为靶物质的DNA链，顺次将四种互补链合成核酸底物(dATP、dCTP、dTTP、dGTP)一种一种地加入到反应液中，进行互补链合成反应。图13(1)中，连接于引物的3′末端的核酸底物是与靶物质上的碱基C131互补的dGTP。由此，在其他的核酸底物(dATP、dCTP、dTTP)中不发生延长。加入到反应溶液中、没用于延长的核酸底物，经以腺苷三磷酸双磷酸酶为代表的核酸底物分解酶而被分解。如图13(1)的dGTP注入时那样，如果发生互补链合成反应则DNA互补链延长，生成作为副产物的焦磷酸(PPi)。此时的反应式示于图13(2)。焦磷酸通过共存的酶的作用而转化为ATP，在荧光素和荧光素酶的共存下反应，产生发光(生物发光)。

如果图示每次各底物注入的发光，以图14作为例子。通常，使用该发光曲线，通过分析每次加入的核酸底物时产生的发光，获知加入的互补链合成底物是否被并入DNA链，并且获知互补链的序列信息并因此获知成为靶物质的DNA链的序列信息。

已知：作为1种互补链合成核酸底物，dATP与作为生物发光底物的ATP具有类似的结构，因此作为荧光素酶的底物而起作用。这成为背景发光信号，使得检测灵敏度降低。作为对策，Nyren等人公开了利用dATP的类似物、具体为dATPαS来代替dATP(专利文献1)。

上述Nyren等人的方法减少了焦磷酸测序法中的背景发光，为提高分析时的发光检测性能做出了贡献。但是，使用含有dATPαS的核苷酸α-硫代三磷酸类似物的方法也有缺点。缺点之一是磷酸基部分的Rp异构体引起的酶活性抑制。Nyren等人对此进行了详细地公开(专利文献3和非专利文献2)，Rp异构体可能抑制聚合酶活性，并且Rp异构体不能被腺苷三磷酸双磷酸酶分解。作为对策，Nyren等人公开了首先仅对Sp异构体进行精制而利用的技术。另外，剩余的Sp异构体被腺苷三磷酸双磷酸酶分解为核苷酸α-硫代一磷酸类似物，此后，当其中的一部分通过酶被再合成为核苷酸α-硫代三磷酸类似物时，Sp/Rp异构体的合成确定是各50％，因此针对Rp异构体合成累积的问题，通过碱性磷酸酶分解Rp异构体并除去。Nyren等人公开了可以通过该方法避免由于Rp异构体引起的聚合酶延长抑制。

进一步地，Eriksson等人公开了作为用于代替dATP的核酸底物，使用7-脱氮-2-脱氧腺苷三磷酸(C⁷dATP)的方法(非专利文献3)。C⁷dATP是将腺嘌呤基的7位氮替换为碳后的物质。因此，三磷酸结构与dATP相同，容易被腺苷三磷酸双磷酸酶分解。即，与作为现有技术的核苷酸α-硫代三磷酸类似物不同，不存在被考虑为酶抑制的主要因素的光学异构体。由此，Eriksson等人公开了可以没有酶抑制的核酸序列分析。

另一方面，虽然在由焦磷酸生成ATP的反应中使用APS，但这也成为荧光素酶反应的底物，产生背景发光。因此，为了高灵敏度地实施碱基序列确定，期望不使用APS的方法。作为使之成为可能的方法，公开了使用酶丙酮酸磷酸双激酶(PPDK)的逆反应，利用AMP和PPi合成ATP的反应的碱基序列确定法(专利文献4)。由于没有使用在现有技术中被指出作为背景发光成分的APS，该方法可以显著地减少背景发光，实现高灵敏度的检测。

现有技术文献

专利文献