[发明专利]采用人工基因线路筛选及量化各种酶活性的方法

说明书

技术领域

本发明涉及筛选及量化各种酶活性的方法，以及以高通量方式基于该方法从宏基因组文库中筛选酶活性的方法。更具体地，本发明涉及采用感测酚类化合物的人工基因线路来筛选及量化各种酶活性的方法，以及以高通量方式从宏基因组中筛选目标酶活性由此获得目标酶基因的方法。

背景技术

生物催化剂被认为是包括用于生产能源、工业材料等的清洁技术的“经济可持续发展”的关键材料，人们已通过多种努力来筛选具有新的化学反应性、特异性和稳定性的酶。在固体培养基上高通量筛选抗生素抗性基因、生长必需的酶、几种工业酶(例如，淀粉酶、脂酶、蛋白酶等)及类似物的方法是已知的，但大多数酶功能依赖于个体的活性分析技术，这需要很长时间和很高成本。

近年来，应用定向进化技术来从微生物基因组或宏基因组中获得新的遗传资源，或提高已知基因的活性来研制很有用的生物催化剂的研究，已经成为生物工程技术中的重要策略。因此，有必要发展用于高通量检测极小量酶的活性的新型高灵敏性筛选技术。

从各种遗传资源，如微生物基因组和环境DNA(宏基因组)中获得新的酶基因的方法，包括基于序列的筛选方法，该筛选方法包含测序DNA，实施PCR反应，以及获得所扩增的基因。随着基因组信息的快速增长，该方法的可利用性逐日增加，且其优点在于可以只特异性地选择想要的基因。然而，该方法缺陷在于，由于其只能在目标基因的核苷酸序列的准确信息已知时才能应用，因此该应用限于一部分遗传资源。

此外，人们也广泛采用了根据基因功能，即酶活性来选择基因的基于功能的筛选方法。为了通过此法筛选酶活性，主要采用了直接从环境样品，包括来自土壤、河流、工业废水、海水和森林的样品中分离微生物的方法。然而，能在实验室中实际培养的微生物种类的数量少到不及自然界中存在的微生物的1％。近年来，积极尝试了通过直接从环境样品中分离DNA而不培养微生物，来构建遗传资源如宏基因组文库的策略。因此，对开发直接从宏基因组文库检测工业上有用的酶活性的筛选技术的关注在增长。

同时，高通量分析酶活性的主要技术包括：1)利用孔板的自动多重检测技术；2)观察固体培养基上的颜色变化或透明带(光环)的方法；以及3)利用营养缺陷型微生物的选择分离方法。这些方法是基于酶的实际活性，并因此优势在于能够准确地选择有想要功能的基因。然而，由于每种酶活性都需要各自的检测技术，因此这些方法的总体应用有限。另外，当外源基因在宿主细胞中的转录、翻译或表达水平低或诸如蛋白折叠或分泌的问题增多时，这些方法的效果也进一步减弱。实际上，对于源自具有高度遗传多样性并且其遗传特性未知的遗传资源(例如新的微生物基因组和宏基因组)的新型酶，它们在重组微生物中的表达水平很低，因而难以将上述高通量检测方法应用于这些酶。因此，一直需要发展新的高通量筛选原理，根据该原理，即使是表达水平很低的酶也可以以高灵敏性检测到其活性。

本文中，关于在酵母三杂交体系中通过基于转录活化原理的基因工程技术检测酶(如细胞内蛋白酶)的活性的人工基因线路的研究被报道并受到关注。另外，采用作为细胞营养物的外源酶的作用得到的产物来检测酶活性，或将来自其它微生物的转录调控蛋白引入到重组大肠杆菌(E.coli)中，通过再设计微生物的代谢途径，来检测重组大肠杆菌中外源基因的酶活性的技术的研究活跃。此外，人们正积极致力于发展用于改变调控蛋白的底物特异性的蛋白质工程技术。例如，人们也研究了改变调控蛋白HbpR的底物特异性，使得HbpR由结合2-羟基联苯(2-HBP)，转向特异性识别以氯-代替羟基-的2-氯化联苯(2-CBP)(Beggah et al.，(2008)Microb.Biotechnol.1(1)：68-78)。

因此，可以将采用调控蛋白来检测酶促反应产物用作筛选新型酶的创新技术。然而，这样的技术仅仅是筛选小量的底物和调控蛋白已被阐明的特异酶活性的技术，这些技术不能作为应用于不同的酶活性的通用系统。

筛选新型酶的其它技术包括由Watanabe研究小组在2005年报道的SIGEX(底物-诱导基因表达筛选)。该技术以筛选其转录活性由添加的底物来诱导的启动子为基础。因此，这不是定向筛选酶活性的技术，而是非定向检测基因的技术。也就是说，该技术不检测与转录活化无关联的酶功能。由于这一技术可以使用FACS分析，因此具有短时间内处理大量样品的优点。然而，该技术难以应用于含有20-30kb大小的大基因的宏基因组文库中，且在文库中不会出现基因方向的GFP活化(Uchiyama et al.，(2005)Nat.Biotech.23：88-93)。