[发明专利]人胚胎干细胞的分化

说明书

相关专利申请的交叉引用

本发明要求于2009年7月20日提交的第61/226,929号专利申请的优先权。

技术领域

本发明提供方法来促进多能干细胞分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞，这些细胞共表达PDX1、NKX6.1，但不表达CDX2和NGN3。

背景技术

用于I型糖尿病的细胞替代疗法的进展以及可移植胰岛的缺乏已使得注意力集中在开发适于移植物移入的胰岛素生成细胞或β细胞的来源上。一种方法是从多能干细胞例如胚胎干细胞产生功能性β细胞。

在脊椎动物的胚胎发育中，多能干细胞可在称为原肠胚形成的过程中产生包括三个胚层(外胚层、中胚层和内胚层)的细胞群体。诸如甲状腺、胸腺、胰腺、肠和肝脏之类的组织将从内胚层，经由中间阶段发育而来。该过程中的中间阶段是形成定形内胚层。定形内胚层细胞可表达多种标志物，如HNF3β、GATA4、MIXL1、CXCR4和SOX17。

定形内胚层分化成胰腺内胚层导致形成胰腺。胰腺内胚层细胞表达胰-十二指肠同源盒基因PDX1。在不存在PDX1时，胰腺形成腹胰芽和背胰芽后不再发育。因而，PDX1表达标志着胰腺器官发生中的一个关键步骤。除了其他细胞类型，成熟的胰腺还包括外分泌组织和内分泌组织。外分泌和内分泌组织来自胰腺内胚层的分化。

据报道，从小鼠的胚胎细胞衍生出了带有胰岛细胞特征的细胞。例如，Lumelsky等人(Science 292：1389，2001)报道了小鼠胚胎干细胞向类似于胰岛的胰岛素分泌结构的分化。Soria等人(Diabetes 49：157，2000)报道，小鼠胚胎干细胞衍生的胰岛素分泌细胞使链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠血糖恢复正常。

在一个例子中，Hori等人(PNAS 99：16105，2002)公开了用磷酸肌醇3-激酶的抑制剂(LY294002)处理小鼠胚胎干细胞得到了类似β细胞的细胞。

又如，Blyszczuk等人(PNAS 100：998，2003)报道了从组成型表达Pax4的小鼠胚胎干细胞产生产胰岛素的细胞。

Micallef等人报道，视黄酸可以调控胚胎干细胞定向形成PDX1阳性胰腺内胚层。在对应于胚胎的原肠胚形成末期的期间，加入胚胎干细胞分化第4天的培养物中时视黄酸在诱导Pdx1方面最有效(Diabetes 54：301，2005)。

Miyazaki等人报道过表达Pdx1的小鼠胚胎干细胞系。他们的结果显示，外源Pdx1表达在所得的分化细胞中明显增强了胰岛素、生长抑素、葡糖激酶、神经元素3、p48、Pax6和HNF6基因的表达(Diabetes 53：1030，2004)。

Skoudy等人报道，激活素A(TGF-β超家族的成员)能上调小鼠胚胎干细胞中的胰腺外分泌基因(p48和淀粉酶)和内分泌基因(Pdx1、胰岛素和胰高血糖素)的表达。使用1nM激活素A时观察到了最大的效果。他们还观察到，胰岛素和Pdx1 mRNA的表达水平不受视黄酸的影响；然而，3nM FGF7处理导致了Pdx1的转录水平升高(Biochem.J.379：749，2004)。

Shiraki等人研究了能特异性增强胚胎干细胞分化成Pdx1阳性细胞的生长因子的作用。他们观察到，TGF-β2可再现地产生更高比例的Pdx1阳性细胞(Genes Cells.2005年6月；10(6)：503-16)。

Gordon等人阐明了在不存在血清的情况下和在存在激活素连同Wnt信号转导抑制剂的情况下从小鼠胚胎干细胞诱导brachyury[阳性]/HNF3β[阳性]内胚层细胞(US 2006/0003446A1)。

Gordon等人(PNAS，第103卷，第16806页，2006年)声称：“Wnt和TGF-β/nodal/激活素信号转导同时为前原条的产生所必需”。

然而，胚胎干细胞发育的小鼠模型可能不会完全模拟高等哺乳动物(例如人)中的发育程序。

Thomson等人从人胚泡分离出了胚胎干细胞(Science 282：114，1998)。同时，Gearhart及其同事从胎儿生殖腺组织衍生出了人胚胎生殖(hEG)细胞系(Shamblott等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：13726，1998)。与可简单通过与白血病抑制因子(LIF)一起培养来防止分化的小鼠胚胎干细胞不一样，人胚胎干细胞必须维持在非常特殊的条件下(美国专利No.6,200,806；WO 99/20741；WO 01/51616)。