[发明专利]肽的重组产生

说明书

本发明涉及重复自组装前体蛋白质、编码其的核酸序列及表达构建体、及通过使用此类前体蛋白质重组产生肽的方法。

发明背景

存在不同已知方法通过生物技术手段来产生肽。因为短的多肽链在微生物宿主细胞中之稳定性通常较低，且因为此类游离肽可对宿主生物产生可能毒性作用(例如抗微生物肽)，所以大多数方法包含产生较大前体蛋白质，在纯化前体蛋白质之后自该前体蛋白质切除肽。

获得稳定前体蛋白质之一可能性包含借助于融合蛋白质表达肽以及稳定蛋白质。该融合蛋白质之性质极大地影响后续处理步骤，其由基本上与肽序列无关之融合配偶体决定，且因此可易于控制且适于产生具有不同序列之肽。

WO 2008/085543描述一种借助于融合蛋白质产生蛋白质及肽之特殊方法。此融合蛋白质除所需肽序列以外亦包含融合配偶体，该融合配偶体确保融合蛋白质具有逆相变行为。此行为首先涉及以简单且廉价之方式自细胞环境中纯化融合蛋白质。其次，在已通过蛋白质裂解将肽移除之后，同样可以简单且廉价之方式移除该融合配偶体。虽然融合蛋白质常可以优良产率获得，但前体蛋白质之肽部分通常较小，且因此此过程之效率并非最佳。

另一方法涉及重复前体蛋白质，其包含重组产生之所需肽的多个拷贝。WO03/089455描述多聚前体蛋白质之产生，通过酸裂解自此类多聚前体蛋白质中切除具有抗微生物性质之所需肽序列。

存在许多其他公开方法(实例：Metlitskaya等人，Biotechnol Appl.Biochem 39；339-345(2004)；Wang及Cai Appl.Biochem and Biotechnol.141；203-213(2007))，其用于证明肽序列或肽序列家族可通过特定方法借助于重复前体蛋白质来产生。在某种程度上，已描述位于所需肽序列之重复序列之间的特点辅助序列之用途。更具体地，已提出阴离子辅助序列，其明显减少重复前体蛋白质内之阳离子抗微生物肽序列对宿主细胞之有害作用(参看例如WO 00/31279及US 2003/0219854)。虽然此重复方法中之前体蛋白质的所需肽序列比例比融合蛋白质之情况高，但所需阳离子肽序列极大地影响此类重复前体蛋白质之性质。

本发明人并不了解涉及根据可以有效方式进行之简单且低成本方案借助于重复前体蛋白质产生任何肽序列之可能性的任何先前方法。

各种抗微生物肽已描述于文献中且概括于评述中(Hancock，R.E.W.及Lehrer，R.1998，Trends in Biotechnology，16：82-88；Hancock，R.E.W.及Sahl，H.G.2006，Nature Biotechnology，24：1551-1557)。

文献中亦描述组合两种活性肽之融合肽。Wade等人报导刻克罗普斯蚕蛾(Hyalophora cecropia)杀菌肽(cecropin)A与毒性蜂毒肽之各种融合物的抗菌作用(Wade，D.等人.，1992，Intemational Joumal of Peptide and Protein Research，40：429-436)。Shin等人描述由20个氨基酸组成的刻克罗普斯蚕蛾杀菌肽A与光滑爪蟾(Xenopus laevis)爪蟾抗菌肽(magainin)2之融合肽的抗菌作用。杀菌肽A由37个氨基酸组成且显示出其对抗革兰氏阴性细菌(Gram-negative bacteria)之活性低于对抗革兰氏阳性细菌之活性。爪蟾抗菌肽2由23个氨基酸组成且对细菌以及肿瘤细胞系具有活性。与天蚕抗菌肽A与蜂毒肽之融合物相比，此融合物显示在可比抗菌作用下明显较低之溶血活性(Shin，S.Y.Kang，J.H.，Lee，M.K.，Kim，S.Y.，Kim，Y.，Hahm，K.S.，1998，Biochemistry and Molecular Biology Intemational，44：1119-1126)。US 2003/0096745 Al及US 6,800,727 B2要求保护由20个氨基酸组成之此等融合肽，及因氨基酸取代、尤其带正电荷氨基酸及疏水性氨基酸之取代而带更多正电荷且疏水性更强的该融合物之变体。

Shin等人，1999描述此天蚕抗菌肽A-爪蟾抗菌肽2融合肽之进一步发展。他们证明具有SEQ ID NO：6之肽的溶血活性比起始融合物低，但其对大肠杆菌(Escherichia coli)及枯草杆菌(Bacillus subtilis)之抗菌活性未受到不利影响(Shin等人，1999 Joumal of Peptide Research，53：82-90)。