[发明专利]色谱系统中的方法

说明书

技术领域

本发明涉及用于确定色谱柱结合能力(binding capacity)的方法、色谱系统以及用于控制色谱系统的方法。

背景技术

溶质的色谱柱的结合能力是工艺色谱中非常重要的因素。该结合能力直接影响色谱步骤的生产力和成本。该结合能力从动态/穿透能力方面定义或作为最大结合能力来定义。该动态能力取决于溶液流过色谱介质填充柱的条件，例如定义为柱体积和进料流率之间的比率的停留时间。如果停留时间无限长，则最大结合能力代表柱的穿透能力。初始穿透能力定义为在流出物中首次检测到溶质时的点处由柱占据的结合溶质的量。穿透能力还可定义为给定的穿透百分比处的能力，其中百分比代表在流出物中存在的来自柱的结合溶质的量，其采用进料中存在的溶质的百分比表达。根据该定义，最大结合能力将等于100％穿透(即不再有溶质能结合到柱的点处)的穿透能力。因此，为了确定最大能力，在不同的穿透水平测量穿透能力，其中这些水平由在样品加载期间在流出物中测量的来自柱的溶质的浓度水平来定义。通常，通过连续监测通过置于流出物线的检测器的流中的信号来确定这些浓度。这些浓度(信号)对时间(或体积或加载质量)的标绘图称作穿透曲线。色谱上穿透的位置和它的形状与有多少溶质能够在柱上结合以及溶质有多快将所有吸附位饱和有关。还示出有在任何给定时间还有多少溶质可以结合到柱。在杂质存在的情况下溶质的穿透结合能力是当发展纯化规程时优化的最关键参数之一。因为杂质大部分情况下具有与溶质相似的吸光性质，结合穿透能力的确定是繁琐和费力的工作。在典型的试验中，来自的柱的流出物采用连续小部分收集，其随后使用例如HPLC等高分辨率技术对溶质进行分析。从而对色谱柱的结合能力的确定是相当复杂的，并且进料溶液浓度在进料施加到色谱柱上的期间随机变化的情况下，无法测量实际的穿透能力。如果想在最佳工艺条件下操作柱，测量实际穿透能力是非常重要的。例如，可以示出，在某些条件下当感兴趣的溶质达到它在柱流出物中的浓度的某一值时，例如它初始浓度的10％，获得捕获色谱步骤的最大生产力。如果穿透能力根据上文描述的方法确定，如果进料浓度或工艺条件(其包括流率和/或色谱介质性质)采用不可预测的方式随时间变化，则无法在确切的10％的穿透时终止柱的加载。

此外，在变化的工艺条件下，确定在不同穿透水平处的穿透能力在连续色谱的情况下是非常重要的。在连续色谱中，若干相同的柱采用允许柱串联和/或并联操作的设置而连接，其取决于方法要求。从而，原则上所有柱可以同时运行，只是方法步骤稍微改变。程序可以重复，使得每个柱在工艺中加载、洗脱和再生若干次。与“常规的”色谱相比，其中单个色谱循环基于若干连贯步骤，例如加载、清洗、洗脱和再生，在基于多个相同柱的连续色谱中，所有这些步骤同时发生只是每个发生在不同的柱上。连续色谱操作导致更好地利用色谱树脂、减少的处理时间并且降低的缓冲需求，所有这些有益于工艺经济。连续色谱有时表示为模拟移动床(SMB)色谱。模拟移动床色谱是周期逆流工艺的一个示例，因为构成系统的所有色谱柱在与样品流相反的方向上周期地同时移动。柱的明显的移动通过使到柱的进入流和从柱的输出流适当地重定向而实现。

Bishop等人(″Simulated Moving Bed technology in Biopharmaceutical Processing(生物制药加工中的模拟移动床技术)″，Bischops，M.和Pennings，M.，Recovery Biological Products XI，(2003)Banff，Alberta，Canada)公开了基于模拟移动床(SMB)技术的连续色谱法，其已经成功地用于具有蛋白A亲和树脂的IgG的实验室规模的纯化。尽管实际上由SMB提供的多柱和多段连续方法极大地提高工艺效率，但至今SMB系统尚未用于cGMP生物制药生产，这主要因为从硬件和操作两个角度的系统的复杂性。操作的角度是特别感兴趣的，因为连续法是更复杂的并且需要许多操作(步骤)在非常精确的预定时间点同时发生。与批量色谱相比之下，考虑工艺变化性的安全因素的实现不建议用于连续工艺，这是因为通过限定，它们在假设仅在到系统的输入没有变化的情况下才能成立的稳定态下操作。