[发明专利]异戊二烯合酶的三维结构及其用于产生变体的用途

权利要求书

1.一种产生具有改进的活性、表达或稳定性的异戊二烯合酶变体的方法，所述方法包括：

a)使用异戊二烯合酶的三维结构鉴定异戊二烯合酶中用于氨基酸置换的至少一个位置，所述至少一个位置能够增加异戊二烯合酶的活性、表达或稳定性；和

b)在所述位置修饰所述异戊二烯合酶以产生具有改进的活性、表达或稳定性的异戊二烯合酶变体。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述位置选自柔性环、二磷酸/金属结合位点、活性位点、异戊二烯基结合位点、表面区域、带负电的区域、铰链区、和静电补缀区。

3.一种产生具有改进的活性、表达或稳定性的异戊烯合酶变体的方法，所述方法包括：

a)基于银白杨异戊二烯合酶的三维结构鉴定异戊二烯合酶表面上的疏水性氨基酸残基；

b)在异戊二烯合酶的表面氨基酸中引入一个或多个氨基酸置换；和

c)鉴定具有相对于SEQ ID NO：45的银白杨异戊二烯合酶氨基酸序列改进所述异戊二烯合酶的活性、表达或稳定性的置换的变体。

4.一种根据权利要求3所述的异戊二烯合酶变体，其中所述疏水性表面氨基酸选自I28、V30、L130、G153、L303、L469和L494。

5.一种通过根据权利要求3所述的方法产生的异戊二烯合酶变体。

6.一种根据权利要求5所述的异戊二烯合酶变体，其中所述变体包含选自I28W、I28T、I28R、I28Y、V30K、L130W、L130K、L130S、L130Y、L130R、L130V、L130I、L130E、L130D、G153K、G153H、G153L、G153W、L303I、L469A、L469Q、L494P、L494C、L494I、L494V、L494S、L494G、和L494D的一个或多个置换。

7.一种异戊二烯合酶变体，其中所述变体包含选自I28、V30、L130、G153、L303、L469和L494的疏水性表面氨基酸的一个或多个置换。

8.根据权利要求7所述的异戊二烯合酶变体，其中突变选自I28W、I28T、I28R、I28Y、V30K、L130W、L130K、L130S、L130Y、L130R、L130V、L130I、L130E、L130D、G153K、G153H、G153L、G153W、L303I、L469A、L469Q、L494P、L494C、L494I、L494V、L494S、L494G、和L494D。

9.一种包含根据权利要求4所述的分离的异戊二烯合酶变体的宿主细胞。

10.一种产生具有改进的活性、表达或稳定性的异戊二烯合酶变体的方法，所述方法包括：

a)基于银白杨异戊二烯合酶的三维结构鉴定异戊二烯合酶的铰链区中的残基；

b)在异戊二烯合酶的铰链区氨基酸中引入一个或多个氨基酸置换；和

c)鉴定具有相对于SEQ ID NO：45的银白杨异戊二烯合酶氨基酸序列改进所述异戊二烯合酶的活性、表达或稳定性的置换的变体。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述铰链区氨基酸选自R198、I229和L260。

12.一种通过根据权利要求10所述的方法产生的异戊二烯合酶变体。

13.一种异戊二烯合酶变体，其中所述变体在选自R198、I229和L260的铰链区氨基酸中包含一个或多个置换。

14.根据权利要求13所述的分离的异戊二烯合酶变体，其中所述变体包含选自I229V、I229L、I229C、I229T、I229P、I229N、L260N、L260M、和L260I的一个或多个置换。

15.一种包含根据权利要求12所述的分离的异戊二烯合酶变体的宿主细胞。