[发明专利]生物法制备的环状亲和标签

说明书

本发明涉及重组蛋白表达、纯化和固定化领域。特别是，它涉及向目的蛋白中引入亲和标签的新方法。

人们已开发出多种亲和标签并应用于整个生物技术领域。亲和标签在整个生物科学领域的巨大成功，促进了人们在开发新的和方便的标记策略方面的兴趣。亲和标签是捕获重组蛋白的完善工具，例如在固定化和/或纯化过程中。最近，这些标签已被用于在许多成像应用以及药物递送中选择性的生物靶向多元蛋白(multiplexed protein)的检测。最常用的亲和标签的范围从短的多肽序列至整个蛋白，其可对溶解度产生有利的影响。例如，小肽表位，如可结合到固定的金属螯合物上的多组氨酸标签，以及可结合到固定的抗体上的myc-标签和FLAG-标签，通常用于重组蛋白的分离和固定。

另一种获得广泛使用的小肽表位是链菌素特异性Strep-标签[Schmidt，等.，蛋白质工程(Protein Eng.)6(1993)109-122；US2006/0106199和US 6,841,359.]。链菌素结合肽序列已通过筛选肽库被发现，其中大多数但并非所有的都包含His-Pro-Gln(HPQ)基序。链菌素融合肽已在各种独特的生化中应用，使链菌素，相对于细菌非糖基化的亲和素成为在许多(链菌素)亲和素-生物素技术中应用的首选蛋白[Keefe，等，蛋白表达和纯化(Protein Expr.Purif.)，23(2001)440-446；Lamla，等，蛋白表达和纯化，33(2003)39-47]。小肽，如Strep-标签可容易地与较大的蛋白融合表达用于纯化或其它的接合应用。标记的链菌素的可用性，以及固定于固相支持物上的链菌素，使这些肽非常有用。以链菌素作为受体系统模型，发现二硫键限制的环肽Strep-基序以高至相应的线性序列3个数量级的亲和力结合链菌素(Giebel等，生物化学1995，34，15430-15435)。Katz等(J.Am.Chem.Soc.1995，117，8541-8547)设计和化学合成了含有基序CHPQGPPC的环状链菌素结合肽，其中二硫键被硫醚交联所取代。报道显示，与它们的二硫键对应物相比，硫醚交联的肽具有增强的稳定性。

因此，环状亲和标签，如环化的链菌素基序比它们的线性对应物更利于作为蛋白标签使用。然而，与含有线性蛋白的，可以简单地通过重组蛋白表达获得的融合蛋白相比，含有环状亲和标签的蛋白的提供需要化学修饰，这在时间、精力和成本上是极不可取的。二硫桥的自发形成通常缺乏特异性，同时桥本身缺乏稳定性。

因此，本发明人提供替代性方法，以提供带有环化的亲和标签的目的蛋白。发现如果标签序列在每侧与能够在酶作用下共同形成共价键的氨基酸侧接，例如与存在于表达编码含有标签序列的目的蛋白的构建体的宿主细胞中的酶侧接，那么线性标签序列可发生生物环化，即非化学的环化。

因此，本发明涉及一种提供包括目的蛋白和环状亲和标签的蛋白物质的方法，其包括下述步骤：

a)提供至少一种前体蛋白物质，该前体包括所述目的蛋白和至少一种通式为X1-标签-X2的基序，其中X1和X2代表侧链可由共价键酶法连接的氨基酸；标签是当环化时能够结合(蛋白)结合配偶体(binding partner)的氨基酸序列；b)使该前体与至少一种能在X1和X2之间形成共价键的酶接触，从而引入包括标签序列的分子内环状结构；以及c)分离所得的环化的蛋白物质。

因此，本发明涉及酶介导的环化的方法。本文中所使用的表述“酶介导的环化”是指至少有一个成环所需的步骤是靠酶来完成的，即非化学的。酶的步骤可在体内(非人类或非动物宿主细胞)或体外进行。酶介导的步骤可包括氨基酸残基的酶修饰(如脱水)，和/或酶法使环闭合。酶法环化可仅包括高反应活性的脱氢丙氨酸的酶法形成，也可包括环化酶作用(Rink，R.，2007.生物化学46：13179-13189)。

特别是，本发明提供用于提供含有目的多肽和环状亲和标签的蛋白物质的酶法，包括下述步骤：

a)提供至少一种前体蛋白物质，该前体含有所述目的蛋白和至少一种通式为X1-标签-X2的基序，其中

X1和X2代表侧链可由能够在残基X1和X2之间形成硫醚桥的羊毛硫抗生素酶(lantibiotic emzyme)连接的氨基酸；

标签是当环化时作为亲和标签的氨基酸序列，所述亲和标签可将蛋白物质捕获到该标签的特异结合配偶体上；

且其中所述基序N端带有羊毛硫抗生素前导序列；

b)使该前体与至少一种能在X1和X2之间形成硫醚桥的羊毛硫抗生素酶接触，从而引入含有标签序列的分子内环状结构；以及