[发明专利]工程改造的肉毒杆菌神经毒素

说明书

相关申请的交叉参考

本申请要求2009年4月14日提交的美国临时专利申请号61/169,031的优先权，其通过引用全文纳入本文用于所有目的。

关于联邦资助研究或开发的声明

本发明在美国政府支持下由以下机构资助进行：NIH基金1-U54-AI-057153。美国政府享有本发明的某些权利。

发明背景

肉毒梭菌(Clostridium botulinum)产生七种不同神经毒素(BoNT)，其在血清学上通过缺少抗血清的血清交叉中和来区分。已知BoNT是对人类最有效的毒素，且是肉毒中毒病的病原体(1)。BoNT发挥作用是通过在神经肌肉连接处抑制所述神经递质乙酰胆碱的释放，引起松弛性瘫痪状态。BoNT通过靶向神经元并切割神经元特异的SNARE蛋白而引起神经元特异的松弛性瘫痪。

SNARE蛋白(可溶性NSF附着蛋白受体)是一个大的蛋白超家族。SNARE蛋白的主要功能是介导神经递质分子胞外分泌到突触后连接。SNARE较小、含量丰富且是囊泡和质膜结合蛋白。

BoNT是含二硫键连接的100kDa重链和50kDa轻链的150kDa多肽链。BoNT分成3种功能结构域：N末端锌金属蛋白酶轻链(LC)、转运结构域(HCT)、C末端受体结合结构域(HCR)(1，2)。BoNT的毒性作用(神经中毒)通过三种关键事件的相互作用完成。一，受体与胆碱神经细胞在所述神经细胞膜上特异结合需要所述重链的羧基部分。结合后，所述BoNT的其他部分将更小的催化结构域移入所述细胞，其中所述催化结构域结合并切割神经元SNARE蛋白，“致毒”所述神经细胞，使其不能“发作”或发送信号。“催化结构域”指触发所述底物切割的所述分子的一部分。所述毒素通过受体介导的内吞作用内化入内涵体，且在突触囊泡和所述质膜的融和后，所述毒素结合突触囊泡相关蛋白的阈限结构域(liminal domains)(3-5)。简言之，BoNT内化入内涵体中且酸化反应后，所述LC转移到胞质中，SNARE蛋白在其内被切割(1，2)。

哺乳动物神经元胞外分泌由所述囊泡SNARE、VAMP2和所述质膜以及SNARE、SNAP 25和突触融合蛋白1a的蛋白复合体的形成来推动(6)。共有七种BoNT血清型(称为A-G)，其切割三种SNARE蛋白之一的特异残基：血清型B、D、F和G切割VAMP-2，血清型A和E切割SNAP 25，和血清型C切割SNAP 25和突触融合蛋白1a(1)。因此，神经元特异性是基于BoNT结合神经元和切割所述SNARE蛋白的神经元同种型。例如，BoNT/A切割人SNAP25但不切割所述人非神经原同种型SNAP 23(7，8)。所述非神经元SNARE同种型涉及不同的细胞过程，包括细胞生长中的融合反应、膜修复、胞质分裂和突触传递。

BoNT中毒后，用新神经替换受毒素影响神经的肌肉功能的可逆性质(10，11)将BoNT从致死的试剂变为神经肌肉病症的新治疗方法。早在1989年，FDA批准BoNT/A用于治疗斜视、脸痉挛、偏侧面肌痉挛以及之后用于宫颈肌张力障碍、美容用途、眉间皱纹和腋窝多汗(12)。BoNT/A在肌张力障碍和其他疾病中的效果与不随意骨骼肌活性有关，伴随令人满意的安全概况，并促进在各种分泌物和疼痛和美容病症中的经验性/标示外应用(13)。

BoNT的临床应用限于靶向影响神经肌肉活性的伤害(12，13)。BoNT结构-功能关系的阐明可以设计使BoNT重靶向独特神经元和非神经元细胞的新疗法。用神经生长因子、鸡冠刺桐(Erythrina cristagalli)的凝集素、或表皮生长因子替代BoNT HCR结构域可使BoNT/A重靶向神经元或非神经元细胞如疼痛传入和气道上皮细胞(14-16)。然而，通过BoNT进行神经元特异SNARE蛋白的选择性切割限制了这些非神经元系统的新疗法的开发。开发新疗法的先决条件需要所述BoNT催化活性重靶向非神经元SNARE同种型。

因此，需要切割非神经元SNARE蛋白的工程改造的BoNT和其使用方法。

发明概述

在一个实施方式中，本发明提供改良的BoNT/E催化结构域，其中轻链残基224、或对应残基224的残基被改变。在一个实施方式中，所述残基224改变为天冬氨酸或谷氨酸。所述的改良催化结构域切割SNAP23但不切割SNAP29或SNAP47。

在另一实施方式中，所述改良催化结构域还包含用于蛋白质递送系统的靶向分子。