[发明专利]利用FRET生物传感器检测配体的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用应用FRET现象的生物传感器来检测配体的方法，更具体地，本发明涉及一种比现有方法更有效地检测配体(特别是糖)并测量所述配体浓度的方法，所述方法使用这样一种现象，当温度高于特定临界温度时，生物传感器中的配体结合蛋白显示出可逆的解折叠，且解折叠变化程度取决于配体的浓度。

背景技术

2002年，斯坦福大学的Frommer首次开发出用于测量麦芽糖的FRET生物传感器(Fehr et al.，PNAS.，99：9846-9851，2002)。从此，相继地开发出用于测量核糖(Lager et al.，FEBS Lett.，553：85，2003)、葡萄糖(Fehr et al.，J.Biol.Chem.，278：19127-19133，2003)或蔗糖(Ha et al.，Appl.Environ.Microbiol.，73：7408，2007)的其它相似类型的传感器。

然而，以前开发的生物传感器显示出非常低的检测能力，因此需要开发可用作更准确的测量工具的高灵敏传感器(Fehr et al.Current Opinion in Plant Biology，7：345，2004)。在为了满足这种需求的尝试中，本发明人以前报道过，可以通过优化生物传感器的蛋白域之间的接头肽来增强用于测量麦芽糖的FRET生物传感器的检测能力(韩国授权专利No.10-0739529(2007年7月29日)和美国专利No.7432353(2008年10月7日))。此外，Miyawaki(RIKENInstitute)通过荧光蛋白的环状排列极大地增强了用于测量钙的FRET生物传感器″Cameleon″的检测能力(Nagai et al.，PNAS.，101：10554，2004)，且Frommer通过将荧光蛋白框内融合到QBP(谷氨酰胺结合蛋白)中，增强了FRET生物传感器的检测能力(Deuschle et al.，Protein Sci.，14：2304，2006)。

然而，通过基因操作来增强FRET传感器需要反复试验，耗时且已达到技术极限。因此，需要一种更有效且更容易的增强FRET生物传感器的方法。

同时，由于蛋白质的三维结构已被阐明，因此对通过改变温度来观察蛋白质结构的可逆变化和热稳定性维持的研究，以及对蛋白质折叠过程预测的研究已经引起研究者的极大注意。大肠杆菌(E.coli)周质-结合蛋白(PBPs)已经成为观察这种蛋白质结构的热动力学变化的良好模型。根据使用示差扫描热量计(DSC)来观察依赖于温度的阿拉伯糖结合蛋白(ARBP)的结构变化的报道，没有阿位伯糖时，可逆解折叠发生在53.5℃；当存在1mM阿拉伯糖时，可逆解折叠发生在59℃(Fukuda et al.，J.Biol.Chem.，258：13193.1983)。此外，有报道称，对于葡萄糖/半乳糖结合蛋白(GGBP)，根据葡萄糖存在或不存在，其解折叠温度从50℃上升到63℃(Piszczek et al.，Biochem.J.，381：97，2004)，而对于麦芽糖结合蛋白(MBP)，在存在麦芽糖时，其折叠温度依赖于pH值增加8-15℃(Novokhatny et al.，Protein Sci.，6：141，1997)。

因此，本发明人对现有的FRET生物传感器测量配体浓度以及检测配体的能力进行了大量的努力，并且结果是，发现当由融合蛋白质构成的生物传感器在发生可逆折叠的特定临界温度下与配体接触时，生物传感器检测配体及测量配体浓度的能力显著增强，从而完成了本发明。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测配体以及测量所述配体浓度的新方法，所述方法增强了现有FRET生物传感器检测配体及测量所述配体浓度的能力。

为了实现上述目的，本发提供了一种利用FRET生物传感器检测配体的方法，所述生物传感器包括含有荧光供体和荧光受体的信号域和含有使荧光供体和荧光受体相连接的配体结合蛋白的感应域，所述方法包括在临界温度范围内使FRET生物传感器接触含有配体的样品，其中在所述临界温度范围内发生可逆解折叠且由配体与配体结合蛋白的结合所产生的FRET比率变化最大。

本发明还提供了一种利用FRET生物传感器来测量配体浓度的方法，所述生物传感器包括含有荧光供体和荧光受体的信号域，以及含有连接荧光供体和荧光受体的配体结合蛋白的感应域，所述方法包括以下步骤：