[发明专利]测定方法和装置

说明书

本发明涉及用于检测分析物存在的方法和装置。更特别地，本发明涉及用于检测针对多态性同种抗原(如HLA抗原)和/或主要组织相容性复合体(MHC)的其他产物的免疫球蛋白的存在的方法和装置。

移植和/或输血程序常常需要筛选受试者是否存在可能结合存在于捐赠者组织或血液上的捐赠者抗原的抗体；这些捐赠者抗原的实例是HLA抗原。

本领域已知的用于HLA测试的方法包括补体依赖性淋巴细胞毒性(CDC)测试，其中用捐赠者的淋巴细胞培养接受者的血清，接着与补体一起培养。然后通过用眼睛分辨死细胞和活细胞来估算细胞毒性的水平。这种方法是劳动密集性的，需要活细胞，可能是非特异性的，并且需要主观评价。

免疫测定，例如，利用免疫系统的机制，其中应答致病的或生物体外来的抗原的存在而产生抗体。这些抗体和抗原，即免疫反应物，能够彼此结合，因此引起高特异性的反应机制，这可以用来确定生物样品中的特定抗原的存在或浓度。

已经描述了用于检测抗-HLA抗体的酶联免疫吸附测定(ELISA)(Zaer等，Transplantation 63：48-51(1997)；美国专利6046013&美国专利5482841)，藉此将从集合的血小板或类淋巴母细胞细胞系纯化的I类HLA分子固定于测定板的孔中并可以用于检测抗-HLA抗体，由此该系统的读出是测试板孔中的光密度变化。Barnardo等(Transplantation，2000年8月15日；70(3)：531-6)证实了单个重组HLA，而不是来自集合的细胞或血小板的抗原，可以用于检测HLA抗原的ELISA形式中。

最近，Jar-How在美国专利5948627中教导了HLA抗原可以附着于微珠上并且可以利用流式细胞计数器，Luminex平台或用于检测结合的抗HLA抗体的相似的装置在流体ELISA测定中进行检测。

这些抗体检测方法缓慢并且需要昂贵的专用实验室设备，如光密度平板阅读器或流式细胞计数装置。缺乏快速的重点照护检验意味着用于同种抗体筛选的所有样品必须进行贮存并分批检验，导致用于移植的不稳定的病房用血液、血液制品和器官的使用延迟。

侧向流动测试或免疫色谱测定已经存在有些时间了。它们是胶乳凝聚测试中所用技术的合理延伸，胶乳凝聚测试首先是由Singer和Plotz在1956年研发的。侧向流动测试的益处包括：快速测试(通常少于10分钟)、易于使用(通常就在样品中蘸一下)、长期稳定性，这使其适于全世界使用。

在它们最简单的形式中，侧向流动测试是吸水试纸条，其中样品通过由吸水试纸条一端的吸收垫产生的毛细管作用沿着试纸条流动。随着样品穿过试纸条，其遇到了有色试剂，通常是已经结合了特异性结合成员(通常是蛋白质或抗体)的微粒。涂覆的微粒与样品混合并结合其配体。珠子-分析物复合体通过试纸条，遇到已经预先用抗体或抗原处理过的线条或区域。根据样品中存在的分析物，有色试剂结合在测试线或区域中。侧向流动测试可以与竞争性测定或夹层测定那样来进行。通常描述两种类型的色谱免疫测定。在一种类型中，检测人流体(尿液、血液、血浆、血清和唾液)中含有的蛋白质或小分子分析物。分析物包括hCG、FSH、LH、CKMB、TSH、肌钙蛋白、肌肉球蛋白、癌蛋白、病毒/细菌蛋白、半抗原、治疗药物和滥用药物。

在其他色谱免疫测定中，待检测的分析物是与以下如病毒/细菌蛋白(HIV、甲肝和丙肝、幽门螺杆菌、EBV、Rubella、CMV、HSV、登革热、Lyme、Chagas、TB、弓形虫、自身免疫抗原等)或过敏原(花粉、霉菌、粉尘/螨类、食物、动物上皮细胞等)等物质特异性反应的人抗体。

为了在侧向流动测试中检测抗体，可以使用各种形式；两种常用的方法是竞争性的或非竞争性的。竞争性的形式依赖于通过标记的竞争性试剂阻止待测试的分析物在试纸条上的测试区结合；用于分析物的阴性测试是由标记的竞争性试剂在测试区引起的颜色变化而产生的。在竞争性测试中，沿着测试区进一步检测到无关标记，表明测定已经进行了工作。在竞争性测定中，测试区可以包含抗原或抗体；如果使用抗原，则竞争性标记的试剂是抗-抗原，其与测试抗体在测试区竞争结合。如果在竞争性测定的测试区使用了抗体，则竞争性试剂是标记的抗原，允许该抗原结合测试样品中的配体并且因此阻止其在测试区的结合。由于以下情况：阴性视觉结果实际上是测试的阳性结果并且因此看上去是违反直觉的，尤其是对于外行，因此竞争性测定没有非竞争性测定那么普遍。