[发明专利]用于理性细胞培养工艺的方法

说明书

发明领域

用重组蛋白质生成哺乳动物细胞进行的生物制药工艺开发在最近数年中已经实现了生产力和产物产量两者的巨大提高。这些成果主要可以归因于细胞系开发、培养基、和工艺优化的进展。仅最近，基因组规模技术实现系统水平分析以阐明哺乳动物细胞中的蛋白质生成的复杂生物分子基础，预示增加的工艺了解及用于进一步工艺优化的以知识为基础的办法的推导。

发明背景

生物制药工艺开发面临服从紧迫项目时间限度开发用于生产临床级材料以进行毒理学研究的高滴度工艺的挑战。在此时间范围内，需要解决表达系统的设计、稳定的高生产细胞克隆(主要为CHO细胞、杂交瘤、BHK、和NSO细胞)的生成和选择、和可缩放的生物工艺的设计，包括培养基优化和工艺控制，以使细胞比生产力和产物产量最大化。在最近数年中，我们已经在重组哺乳动物细胞培养物中看到了巨大的产物滴度升高，例如目前对于CHO细胞中生成的免疫球蛋白，产物浓度明显在5g/L之上。分子和细胞生物学(包括细胞系工程)、培养基设计、和工艺控制策略(例如通过营养物补料来进行)的成果为此进展铺平道路。

虽然瞄准更宏观的生物工艺分析，例如通过应用在线光谱学来进行，但是FDA还提出基于综合工艺数据分析的以知识为基础的连续工艺改善，如其工艺分析技术(Process Analytical Technology，PAT)倡议中所显示的，所述倡议推动连续的且创新的(生物)制药工艺开发。

从工艺科学观点看，存在着进一步的工艺改善会需要对细胞(内)生成系统自身的更详细的了解的挑战，即对生理学表型的了解增加，如在给定的培养系统(例如微量滴定板、摇瓶、台式或生产规模生物反应器)中观察到的。这里，主要的挑战由如下的实情给出，即细胞中的生物学信息流动和物质流量在许多不同水平发生，并且遵循复杂的控制机制。大规模技术诸如转录物组学(transcriptomics)、蛋白质组学或代谢物组学(metabolomics)的进展可以提供关于生物学系统状态的大量数据。然而，使某种细胞成为高生产细胞的遗传和生理学特性是复杂的，而且尚未完全了解(Seth G，Charaniya S，Wlaschin KF，Hu WS.In pursuit of a super producer-alternative paths to high producing recombinant mammalian cells.Curr Opin Biotechnol 2007；18：p557-564)。

实质上，对工业工艺开发的应用要求来自这些基因组规模技术的数据可以转化成适合于生物工艺设计的信息。基因表达序型测定容许在充分建立且稳健的实验平台上的大规模转录物数据生成。然而，此技术不能阐明重要的生理学信息，例如关于翻译后修饰、酶活性或代谢流量。此外，工业相关哺乳动物细胞系诸如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)仍缺乏基因组序列信息。

发明概述

在本发明中，使用CHO特异性Affymetrix微阵列(Wlaschin KF，Nissom PM，Gatti ML，Ong PF，Arleen S，Tan KS，Rink A，Cham B，Wong K，Yap M，Hu WS.EST sequencing for gene discovery in Chinese hamster ovary cells.Biotechnol Bioeng 2005；91：p 592-606；Yee JC，Wlaschin KF，Chuah SH，Nissom PM，Hu WS.Quality assessment of cross-species hybridization of CHO transcriptome on a mouse DNA oligo microarray.Biotechnol Bioeng 2008；101：p1359-1365)来实施基因表达序型测定作为以工业补料分批工艺形式培养的IgG生产CHO细胞系中的原理实验的证据，以评估此技术在生物制药工艺开发中的潜在用途。明确且例示性地，我们调查了应用两种不同营养方案的代表性高滴度和低滴度补料分批工艺的时间过程期间的基因失调的数目和程度。我们给代谢网络和生物学功能赋值以鉴定差别表达的基因，并且使用脂质代谢的例子，评估与途径导向性数据分析组合的基因表达数据是否也可以用于以理性方式优化标准工艺形式的培养基组成。