[发明专利]检测抗生素耐药细菌的方法和试剂盒

说明书

本发明涉及引起细菌碳青霉烯耐药性的碳青霉烯酶抗性基因的检测方法和试剂盒。本发明提供可用于所述检测的寡核苷酸引物。所述方法可用于在单个反应内检测OXA‑48、SME、GIM‑1、VIM 1‑22、SPM、GES 1‑10、KPC 1‑7、IMI 1‑3/NMC‑A、IMP 1‑24，和在另一个单个反应内检测OXA‑23群、_OXA‑24群、具有ISabaI启动子的OXA‑51群、OXA‑55、OXA‑58、OXA‑60、OXA‑62、CMY 1、‑10、‑11、SFC‑1、NDM‑1、和SIM‑1。

本发明涉及引起细菌碳青霉烯耐药性(即碳青霉烯耐药菌)的碳青霉烯酶基因的检测方法和试剂盒。本发明还涉及可用于所述检测的寡核苷酸引物。

对β-内酰胺抗生素、例如青霉素和头孢菌素(kefalosporins)耐药性的增加，提出了由革兰氏阴性杆菌引起的感染的治疗问题。因而，必须越来越经常用广谱抗生素替换β-内酰胺抗生素。

碳青霉烯代表了治疗难治性医院感染的重要的广谱抗生素类别。碳青霉烯通常对最需氧的革兰氏阳性和革兰氏阴性菌以及对厌氧菌有效。经常使用的碳青霉烯是亚胺培南、美罗培南和厄他培南。住院患者，特别是希腊、以色列、美国、土耳其和远东(中国)以及中美洲的住院患者，都出现了对这些药物耐药的菌株。

对碳青霉烯敏感性降低的典型细菌是大肠杆菌(E.coli)、克雷伯氏菌属(Klebsiella sp.)及其他肠杆菌属(Enterobacteriaceae sp.)。此外，铜绿假单胞菌和它在环境源中密切相关的菌种，以及患者中存在的危害免疫应答的不动杆菌属(Acinetobacterium sp.)，经常对碳青霉烯的敏感性降低。

对碳青霉烯抗生素的敏感性降低可以由上百个不同的β-内酰胺抗生素耐药性基因中的一个或多个与细胞壁渗透性改变(例如特定的孔蛋白改变)和/或与ampCβ-内酰胺酶的过量生产有关的主动流出相结合而引起。这通常引起碳青霉烯敏感性降低，这种降低经常是可逆的，当抗生素治疗结束时终止。对此的原因在于该机制的维持对细菌是耗能的，并对它的营养供应不利。

碳青霉烯耐药性的另一种并且更重要的原因是降解碳青霉烯抗生素的酶，称为碳青霉烯酶。与野生型细菌相比较，在碳青霉烯酶存在下，细菌不需要费大力进行竞争。因此，碳青霉烯酶单独就可以是显著的碳青霉烯耐药性的原因。这种机制可以与前面提到的机制组合出现，增加了敏感性降低和随之而来的耐药性。碳青霉烯酶基因可以存在于染色体中和质粒中。特别是位于质粒中的那些基因，容易转移到其它菌种中，例如在广谱β-内酰胺酶(ESBL)菌株中的那些基因。产生碳青霉烯酶的菌株往往也是ESBL-菌株。尤其是肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)碳青霉烯酶(KPC)-和Verona imipenemase(VIM)-基因家族对现行的抗生素治疗是潜在的威胁。因为KPC-生产菌可能难以基于常规的抗菌素敏感试验检测到，所以它们可能在感染控制措施中造成问题。另一种常见的具有碳青霉烯酶性质的β-内酰胺酶家族是Guiana超广谱β-内酰胺酶(GES)，它也特别难以基于常规抗菌素敏感试验来测到。

碳青霉烯耐药基因在环境物种中的大贮备结合碳青霉烯日益增加的应用，激起了可能一直末被检出的罕见或新的碳青霉烯酶基因出现的风险。另一方面，碳青霉烯耐药性可以由如上所述的可逆的机制所引起。因此，需要有改进的方法来检测生物样品中引起碳青霉烯耐药菌的碳青霉烯酶基因。

概要

本发明的目的是解决现有技术的至少一部分问题。

具体而言，本发明的目的是提供查明生物样品是否包含对碳青霉烯抗生素类型耐药的细菌的方法。

更具体说，本发明的目的是提供引起细菌碳青霉烯耐药性、即引起对碳青霉烯类型抗生素耐药性的碳青霉烯酶基因的筛查方法。

本发明是基于应用分子生物学方法从生物样品中筛查耐药基因。具体而言，本发明是基于应用专门设计的、能够检测引起碳青霉烯耐药性的碳青霉烯酶基因的引物。这些方法可用于代替生化方法或与其结合。