[发明专利]永生化的禽类细胞系及其用途

说明书

描述 

技术领域

本发明涉及用于产生生物制品包括病毒和蛋白质的细胞系领域。本发明特别涉及特定的永生化禽类细胞系，其表达端粒酶逆转录酶(TERT)及呈现出不同的生物制品产生模式。本发明更特别涉及永生化禽类细胞系，其能扩增黄病毒科病毒，但是不能扩增痘苗病毒毒株Copenhagen(VV-COP)和修饰的痘苗病毒Ankara(MVA)，或者既能扩增黄病毒科也能扩增痘病毒科病毒。本发明进一步涉及所述永生化禽类细胞系的应用及产生生物制品包括病毒和蛋白质的方法。 

发明背景 

禽类细胞多年来用于生产病毒疫苗。例如，含胚鸡卵能支持众多人和动物病毒、包括削弱了在人或哺乳动物细胞中复制潜力的明显减毒的病毒的复制。用于人病毒疫苗生产的含胚鸡卵必须证明没有限定的病毒和细菌污染物(无特定病原体或SPF)。含胚鸡卵成本较高且可以占多达40％的病毒疫苗成本。直至SPF供应商证实用于生产一批疫苗的含胚鸡卵的亲代鸡完全没有任何疾病，该批疫苗才能被发放。这种不确定性显然增加了制备这些疫苗的成本。此外，大规模感染卵及维持病毒生长的方法耗时较长，且有时在不同的疫苗批次之间有不同。 

随着细胞培养技术的开展，疫苗生产者已经用分离的鸡胚成纤维细胞(CEF)代替含胚鸡卵。大多数黄病毒科病毒疫苗例如从CEF中生产。由世界卫生组织(WHO)推荐的黄病毒科黄热病毒疫苗是从17D毒株和次代毒株中制备的，其在核苷酸序列和等价免疫原性方面略有不同(CAMACHO L.A.B.et al.，Rev Saude Publica 38(5)：671-8(2004)；DOS SANTOS CN.，Virus Res.35：35-41(1995))。关于黄病毒科病毒生产方法的实验结果已经导致建立了使用17DD病毒毒株在CEF中生产黄热病毒疫苗的有效方法学(FREIRE M.S.，Vaccine 23，2501-2512(2005))。虽然使用CEF改善了生产方 法的安全模式、效率和可靠性，但是其也是高耗时及高成本的方法。CEF的产生依赖于SPF鸡卵的可得性。CEF是通过切碎胚胎以建立和扩增存活细胞而从SPF鸡卵中制备的。对于原代动物细胞典型的是，成纤维细胞经历衰老：随着传代而增加的倍增时间以及最后所有细胞均死亡。这个过程在大约20次传代后发生。这种有限的存活限度限制了对每批CEF进行完整安全性测试。 

由于如先前所述含胚鸡卵和CEF在生产病毒疫苗中的局限性，因此在过去的几十年中一直尝试寻找新的细胞培养系统。在此方面，永生化细胞系极具吸引力。一批批的永生化细胞系可以在生产场所维持或者冷冻，且总是可以为新的产生方法所利用。此外，由于其在生产工厂是受限的，因此其不易被外源污染物污染。使用其使得可以大幅度削减生产过程所需的人工处理。所有这些性质使得成本和生产时间均降低，以及潜在的污染减少。此外永生化的细胞系可以被充分鉴定，且因此总是符合实验室管理规范及不同医疗机构的要求。例如，VERO细胞系已经被描述为是生产黄病毒科病毒疫苗的替代候选物以代替许可的含胚鸡卵。活的减毒的日本脑炎病毒疫苗ChimeriVax^TM-JEV在培养于补加胎牛血清的培养基中的VERO细胞中增殖(MONATH et al.，Biologicals，33：131-144(2005))。相似地，MATEU et al.(Trans.R.Soc.Trop.Med.Hyg.，101(3)：289-98(2007))和TORINIWA et al.(Vaccine，4；26(29-30)：3680-9(2008))已经分别在VERO细胞系中生产了黄热病毒疫苗和日本脑炎病毒疫苗。永生化细胞系的应用不限于病毒疫苗，其也可扩展为重组蛋白质。例如，抗体和流感病毒疫苗均可以在PER.C6细胞系(ECACC number 96022940)、通过用腺病毒类型5的E1小基因转染而永生化的人胎儿成视网膜细胞系(FALLAUX F.J.et al.，Hum.Gene Ther.9：1909-17(1998)；PAU M.G.et al.，Vaccine 19，2716-2721(2001)；YALLOP C.et al.，Animal Cell Technology meets Genomics，533-536(2005))上增殖。