[发明专利]测定肌醇六磷酸（IHP）的方法

说明书

本发明涉及测定可注射进人或动物中之产品或该产品之级分(特别是红细胞悬液)中的肌醇六磷酸(或IHP)的方法。

IHP是血红蛋白的强效变构效应物。因此，它可用于降低血红蛋白与氧的亲和力并使组织中的氧释放增加。在癌症学(特别是缺氧肿瘤(hypoxic tumor))中，它可用作放射治疗辅药。WO-A-2006/016247描述了将IHP包封于作为生物运载体的红细胞中。

包封IHP之红细胞的临床应用需要知道所存在的IHP量，从而能够根据处方剂量确定所要输注的悬液体积。此外，由于IHP是一种金属螯合剂(例如钙螯合剂)，如果以游离形式施用可能会潜在地具有有害作用，因此测定最终药物产品中存在的细胞外IHP也是很有必要的。

文献中已描述了多种测定IHP的方法。这些方法大多是为了测定食物提取物中存在的IHP而开发的。根据方法是直接的、间接的或者酶促的，这些方法可分为3类。

在直接法中，特别地涉及质谱法、核磁共振法、电导分析法和折射分析法，这些方法都需要待分析的样品是高纯度的，因而需要很长的实施时间。

间接法是基于IHP与金属离子的络合能力，可以通过比色法或荧光分析法对形成的[金属离子-IHP]络合物进行测量。Kenan Dost，Ozge Tokul(Analytica Chimica Acta 558(2006)：22-27)描述了间接测定小麦和基于小麦之产品中的IHP的方法。该方法是基于存在IHP时无色络合物[Fe(III)-肌醇六磷酸]置换有色络合物[Fe(III)-硫氰酸盐]的反应。通过与UV-可见光分光光度检测仪偶联的高效液相色谱法(HPLC)进行读数。

还由Plaami等人(Journal of the association of official analytical chemists，the association，Arlington，VA，US，1991，74，32-36)已知测定谷物中存在的肌醇六磷酸的方法。该公开的方法是基于用电感耦合等离子体原子发射光谱法(inductively coupled plasma atomic emission spectrometry，ICP-AES)测定肌醇六磷酸中所含的磷。

还由Park等人(Butterworth，London，2006，17(9)，727-732)已知用于测定儿童食品中肌醇六磷酸之量的多种方法。所描述的方法之一是根据Latta和Eskin(J.Agric.Food.Chem.，1980，28，1315-1317)的分光光度法，其需要利用离子交换树脂进行色谱分析的步骤。根据Park等人测定肌醇六磷酸的最佳方法是AOAC法。

酶促法是基于利用称为“肌醇六磷酸酶”的酶使IHP水解；这些方法不适用于测量红细胞内的IHP。

文献中所描述的有关农产品中的测定方法不能直接转用到含有IHP之药物产品的情形中，特别是因为其组成存在显著差异。本文中的这些著述不应视为评价本发明之专利性的有力证据。

还可以在文献中找到涉及利用直接法测定红细胞中IHP的研究，这些直接法具有某些缺陷，使其不适用于药物产品生产的常规测定中。

S.Villa等人(Adv Exp Med Biol.1992；326：41-49)描述了通过HPLC测量红细胞中IHP的简便、可靠的方法。所提出的分析方法包括下列步骤：

●通过裂解掺有IHP的红细胞并用高氯酸提取来制备样品，

●制备流动相，并使HPLC柱平衡，

●使样品通过柱，

●通过折射分析法测量IHP的浓度。

但是，这种方法需要通过HPLC分离样品，因此其实施时间很长。需要指出的是，制备标定范围需要测定10个不同的IHP浓度，每个浓度测试数次；估计其持续时间可为6小时。此外，该方法的检出限(0.5mM)不足以对终产品中存在的细胞外IHP进行定量。该方法不能满足工业规模生产对测定快速性和灵敏度提出的要求。

B.Teisseire等人(J.Appl.Physiol.1985年6月；58(6)：1810-7)评估了向仔猪中输注入掺有IHP之红细胞的生理作用。该文章描述了一种测量红细胞中IHP的方法，其基于测定IHP掺入之前和之后细胞内磷酸盐的浓度。这两个浓度之间的差异是由IHP引起的。这种估计程度很大的方法不适用于对治疗用产品的红细胞中IHP进行测量。