[发明专利]包含编码烯醇丙酮酸磷酸羧激酶和/或丙酮酸正磷酸双激酶的构建体的转基因植物

说明书

本发明涉及用于制备转基因植物的遗传构建体。该构建体在叶衰老期间具有引起氮素再动员的能力，使得氮可从叶转移到植物的其它部位。本发明提供用这种构建体转化的植物细胞和转基因植物本身。本发明还涉及产生转基因植物的方法和在衰老植物中提高氮素再动员(nitrogen remobilisation)的速度的方法。本发明还涉及已用遗传构建体转化的收获的植物叶(例如烟草叶)和包含这类收获的植物叶的吸烟制品。

叶衰老是植物发育的一个阶段，期间，细胞在细胞死亡前经历独特的代谢和结构变化。生理学和遗传学研究表明衰老是一个被高度调节的过程。叶经过衰老的进程因由叶绿体解体所造成的叶绿素丧失并随之变黄而十分明显。例如，可通过溶剂提取和分光光度测定或通过叶绿素含量测定仪，测量这个发育阶段特有的下降的叶叶绿素水平。与对同一植物(优选生长在恒定条件下)所记录的较早的叶叶绿素水平相比，叶叶绿素水平下降表明衰老。

分子研究表明，衰老与基因表达的改变有关。编码参与光合作用的蛋白质的mRNA水平在衰老期间下降，而编码被认为参与衰老的蛋白质的基因的mRNA水平升高。衰老是一个极有组织的过程，受称为衰老相关基因(SAG)的基因调节。叶衰老包括蛋白质、核酸和膜的降解，以及由这种降解所致的营养物随后转运到植物的其它部位，例如发育中的种子、叶或贮藏器官。植物衰老的一个问题是衰老叶中存在的许多有用的矿物质和营养物将保留在叶中，随着叶死亡，实际上会损失掉。例如，衰老叶中存在的氮(可呈氨基酸上的氨基形式)，如果不离开垂死的叶，则将会浪费掉。

因此，在植物中，尤其在它们变衰老时，加强氮素再动员在作物生产中可具有重要应用。首先，从叶中再动员起来的氮可转运到较幼嫩的叶以及发育中的种子中。因此，氮从衰老叶中离去的效率的提高可潜在地增加植物种子和较幼嫩部分的氮供应，从而提高作物产量和氮利用效率。在世界人口增加但作物产量的增加不足以满足需要时，这显然是有价值的目标。一种潜在的目标作物是欧洲油菜(Brassica napus)(油料种子油菜)，其由于营养组织的氮素再动员差而造成氮效率低下。另一种目标作物是小麦，因为增加籽粒蛋白含量的潜在益处非常大。籽粒蛋白含量不仅仅影响小麦的营养价值，而且还决定籽粒使用率，并由此决定市场价值。例如，籽粒蛋白含量增加引起面包体积加大。同样，在烟草工业中提高氮素再动员的能力可能十分有用，因为已知烟草叶中残留的氮有助于形成亚硝胺类。

酶烯醇丙酮酸磷酸羧激酶(PEPCK或PCK)[EC 4.1.1.49]和丙酮酸正磷酸双激酶(PPDK)[EC 2.7.9.1]是已知的。PPDK存在于原核生物和真核生物两者中，就序列和三级结构而言，在细菌和高等植物之间是保守的(Pocalyko等，1990，Biochemistry，29，10757-10765)。该酶在下列反应中催化丙酮酸的可逆磷酸化形成磷酸烯醇丙酮酸(PEP)(Carroll等，1990，Federation of European Biochemical Societies，274，178-180；Hatch和Slack，1968，Biochemical Journal，106，141-146)：丙酮酸+Pi+ATP＝PEP+PPi+AMP。在C3和C4植物两者中，PPDK基因具有独特的结构，其中由同一基因产生两种转录物。较长的转录物编码叶绿体蛋白质，其第一外显子编码叶绿体转运肽，而较短的转录物由较长转录物的第一内含子内的独立启动子转录，因此缺乏编码叶绿体转运肽的第一外显子。这种较短的转录物产生PPDK的胞质同工型。已在玉米、水稻、C3和C4黄花菊属(Flaveria)品种和鼠耳芥(Arabidopsis thaliana)中报道了这种基因结构。

烯醇丙酮酸磷酸羧激酶(PCK)在下列反应中催化ADP、二氧化碳和磷酸烯醇丙酮酸之间形成ATP和草酰乙酸的可逆反应：草酰乙酸+ATP＝PEP+ADP+CO₂。研究表明，PCK存在于多种植物组织细胞的细胞溶胶中。这些组织包括发育中的种子、藻丝和根。在植物中，PCK出现在其中含氮化合物代谢高的组织中。

本发明人构建了多个遗传构建体，其中将编码酶PCK和/或PPDK的基因单独或共同置于启动子的控制下，以便测定这些基因的过表达对衰老叶中的氮素再动员有哪些作用(如果有的话)。

根据本发明的第一个方面，提供包含与至少一个编码序列有效连接的衰老特异性启动子的遗传构建体，所述编码序列编码至少一种具有烯醇丙酮酸磷酸羧激酶(PCK)活性和/或丙酮酸正磷酸双激酶(PPDK)活性的多肽。