[发明专利]制备特异性位点生理活性多肽结合物的方法

说明书

技术领域

本发明涉及制备一种特异性位点生理活性多肽结合物的方法，更特别地涉及一种通过将生理活性多肽和非肽基聚合物连接从而以高产率制备所述结合物的方法。

背景技术

由于其低稳定性，肽类很容易变性，被蛋白酶体内降解，并由于其相对小的尺寸而从肾脏中排泄出去。因此，为了以其活性形式维持肽药物在血液中的具体浓度，需要频繁给予患者肽药物。然而，肽药物通常是以注射制剂形式给药的，这种频繁给药引起患者的严重不适。为了解决此问题，已经开发了很多方法，例如通过增加肽药物通过生物膜的渗透，经咽或经鼻吸入将肽药物转移的方法，通过抑制酶促降解从而稳定肽，修饰对蛋白酶敏感的特定氨基酸序列(例如阻止由二肽基肽酶引起的效价损失的GLP-1氨基酸序列)的方法，以及在肽的表面化学添加一个高溶解度的非肽基聚合物，例如聚乙二醇(PEG)的方法。

PEG，已经被用作非肽基聚合物中的一种，它和靶向肽的一个特异性位点或多个位点非特异性地结合，从而达到增加肽的分子量的效果，所得的PEG-肽复合物耐受肾脏损失和酶水解，而无任何副作用。例如，国际专利公开文本WO 2006/076471描述了通过将用作充血性心力衰竭治疗剂的B-型利尿钠肽(BNP)和PEG结合从而维持生理活性，美国专利US6,924,264描述了通过将PEG和其上的赖氨酸残基结合而增加药物exendin-4的体内滞留时间。

这些方法通过增加PEG的分子量延长了肽的体内滞留时间，但是由于分子量增加，肽药物的效价显著降低。此外，PEG的非特异性结合可能遮蔽生理活性多肽的活性域从而显著降低多肽活性。

从而，需要开发一种改善的用于制备生理活性多肽和非肽基聚合物的结合物的方法，其中聚合物以在不影响多肽活性的特异位点的方式和肽连接。

本发明人通过证实通过调节反应媒介的pH和醇含量以高产率制备出在特异性位点连接有非肽基聚合物的生理活性多肽的结合物完成了本发明。

发明内容

因此，本发明的一个目的是提供一种高产率制备生理活性多肽结合物的方法，在所述生理活性多肽结合物中非肽基聚合物在特异性位点和生理活性多肽相连接。

与本发明的一个方面相一致，提供了一种制备特异性位点生理活性多肽结合物的方法，包括步骤：i)将生理活性多肽和非肽基聚合物置于包含特定量的醇和特定pH以使非肽基聚合物和生理活性多肽的靶向位点结合的反应媒介中进行反应；ii)从步骤i)的反应混合物中使用醇并通过离子交换色谱分离和纯化生理活性多肽结合物。

附图说明

当考虑到下文附带的附图时，下文对本发明的描述将使本发明的上述和其他目的和特征变得明显，其各自如下：

图1：使用SOURCE S柱纯化DA-exendin-4-PEG的位置异构体的图谱；

图2：使用SOURCE S柱纯化CA-exendin-4-PEG的位置异构体的图谱；

图3：显示当在不同pH值下对CA-exendin-4聚乙二醇化时获得的第27位赖氨酸聚乙二醇化的异构体的曲线图；

图4：显示当在45％乙醇中于不同pH值下对CA-exendin-4进行聚乙二醇化时获得的第27位赖氨酸聚乙二醇化的异构体的曲线图；

图5：显示当在不同量(％)乙醇中于7.5的pH值下对CA-exendin-4进行聚乙二醇化时获得的第27位赖氨酸聚乙二醇化的异构体的曲线图；

图6：显示当在不同量异丙醇(％)中于7.5的pH值下对CA-exendin-4进行聚乙二醇化时获得的第27位赖氨酸聚乙二醇化的异构体的曲线图；

图7：CA-exendin-PEG-免疫球蛋白Fc的SDS-PAGE分析；

图8：CA-exendin-PEG-第12位和第27位赖氨酸的SDS-PAGE分析；

图9：通过肽图分析的CA-exendin-4第12位赖氨酸聚乙二醇化的异构体的分析图谱；

图10：通过肽图分析的CA-exendin-4第27位赖氨酸聚乙二醇化的异构体的分析图谱；

图11：使用SOURCE S柱纯化胃泌酸调节素-PEG的位置异构体的图谱；

图12：使用SOURCE S柱纯化咪唑并-乙酰基胃泌酸调节素-PEG的位置异构体的图谱；

图13：通过肽图分析的胃泌酸调节素的第30位赖氨酸聚乙二醇化的异构体的分析图谱；

图14：使用SOURCE Q柱纯化咪唑并-乙酰基胃泌酸调节素-PEG和免疫球蛋白Fc的结合物的图谱；