[发明专利]用于鉴别液体培养基中的微生物的方法

说明书

本发明涉及用于鉴别液体培养基中的微生物的方法。

需要24至48小时的时期来鉴别培养在生物学液体中的微生物。

事实上，液体培养基中的微生物培养物必须在固体培养基上被亚培养。

此时间段对于在拿到抗菌谱的结果之前迅速开始适当的经验性抗生素治疗的需要而言是不利的。

直接应用于血液培养物的分子生物学技术(PCR)是更快的；然而，它们花费至少约3个小时并且需要适当的设备和一定程度的专业技术。

WO 02/21108(Large Scale Proteomics Corp.et al)涉及检测和表征微生物，包括通过2D离心将微生物从混合物中分离。

Chen等人在Anal.Chem.2008，80，8694-8701和J.Proteome Res；July 2007：6(7)；2529-2538中的文章公开了用于在蛋白质组学中有用的质谱分析法的张力-活性试剂。

本发明人的工作焦点集中在寻求用于克服现有技术的缺点的手段。发明人充分利用他们在细菌学和通过质谱分析法分析微生物方面的专业知识，力求使得MALDI-TOF MS(基质-辅助的激光解吸/电离飞行时间质谱分析法)技术适合于鉴别液体培养基中的微生物。

已知在固体培养基上生长的细菌目前可通过MALDI-TOF MS而被鉴别，这多亏了由菌落直接获得的种的特异性特征谱。

发明人发现通过适当地处理包含在液体样品或生物学样品(无论此样品是否已被富集于液体培养基中)中的微生物可以使用这一技术。

因此，本发明的目的是提供用于鉴别液体培养基中的微生物的新方法。

本发明的方法的特征在于，将膜去垢剂加入含有被微生物感染的宿主组分(即细胞组分和来自细胞外环境的蛋白质)的液体培养基中，从而从这些组分中释放微生物而不降解它们，并且本发明的方法的特征在于通过MALDI-TOF MS来分析生长在液体培养基中的微生物。

更具体地，本发明的方法包括步骤：

-向液体培养基中加入不损坏原核生物的细胞壁的温和膜去垢剂，以便将微生物与被感染的宿主的组分分离，特别是释放细胞内的微生物；以及以便于获得具有降低的背景噪声的谱，因而允许容易地鉴别微生物；

-通过差速离心从所述液体培养基中回收微生物；和

-通过MALDI-TOF MS分析所述微生物沉淀，然后将结果与适当的微生物数据库进行比较。

此技术具有快速的优点：其通过避免在固体培养基上进行亚培养而在鉴别过程中节约了至少24h的时间，从而使得可以开始适当的抗生素治疗而没有时间损失。此外，所述技术易于实施。

加入液体培养基中的温和膜去垢剂的终浓度为最多5％，更优选为0.5％-5％，最优选为1％。

根据其它的条件，所加入的去垢剂的终浓度为1％至5％，优选2％。

适当的化合物包括皂角苷，正辛基糖苷，正十二烷基糖苷，辛酰-N-甲基葡糖酰胺，癸酰基-N-甲基葡糖酰胺，正十二烷基-β-D-麦芽糖苷。

皂角苷是优选的去垢剂。

有利地，含有待分析微生物的液体与去垢剂之间的接触时间最多为8分钟，更优选为1-8分钟，更特别地为大约5分钟。

将混合物离心，优选在加入蒸馏水之后进行。

适当的离心条件为最多20,000rpm，特别是10,000-15,000rpm，最多离心15分钟，优选大约1-15分钟，更特别地为大约2分钟。

根据其它的条件，最多以8000t/min进行离心，优选3000-5000t/min，最多离心15分钟，优选大约5-15分钟，更特别地为大约5分钟。

然后弃去上清液，取沉淀到蒸馏水中并离心，有利地在上文定义的条件下离心。回收沉淀并将其用于MALDI-TOF MS分析。将所获得的结果与数据库进行比较。

在根据本发明的方法中所使用的液体包括，例如，来自对于特定微生物呈阳性的患者的血液培养物，在手术室中被接种或未被接种于血液培养管中并产生对于特定微生物呈阳性的培养物的关节液，或任何其它生物学液体，例如尿、脑脊液、来自引流物或脓肿的引流液，条件是感染被怀疑是单微生物感染。这可直接由生物学液体检测或富集后在液体培养基中检测(当接种物稀少时)。