[发明专利]纳米粒子制备的糖脂免疫抗原

说明书

技术领域

本发明涉及一种新型纳米粒子制备的糖脂抗原，该糖脂抗原对触发免疫系统释放抗癌和抗病毒细胞因子具有较强的活性。与早先发明的糖脂抗原相比，这种新型的纳米粒子制剂不会造成免疫系统的无反应性(刺激后无应答)，也可以重复用来治疗长期疾病，例如癌症和慢性病毒性疾病。

背景技术

α-半乳糖苷神经酰胺(KRN7000)(A1pha-galactosylceramide)：一种有效的免疫疗剂。α-半乳糖苷神经酰胺(又称为KRN7000)是一种海绵派生的鞘糖脂(参见美国专利US 5780441)。它是NKT细胞的超拮抗剂抗原，通过Th1细胞因子(干扰素)介导机制，限制小鼠模型黑色素瘤转移并抑制乙肝病毒的复制。在一些包括癌症以及丙肝患者的临床试验中，已经验证了α-半乳糖苷神经酰胺的安全性，并且它可以强烈诱导Th1细胞因子应答。

自然杀伤T(NKT)细胞是亚群独特的淋巴细胞，其具有T细胞和NK细胞的标记和功能。NKT细胞在抗原(α-半乳糖苷神经酰胺)刺激的两小时内激活，并产生大量的Th1和Th2细胞因子。除了分泌细胞因子，NKT细胞还在启动几种类型的免疫细胞之间的细胞与细胞接触及通讯中发挥极其重要的作用，包括树突细胞、巨噬细胞、CD4T细胞和CD8T细胞。与识别肽抗原的常规T细胞相比，NKT细胞识别由非多态MHC样分子CD1d呈递的脂类抗原。

可溶性α-半乳糖苷神经酰胺诱导NKT细胞的无反应性。α-半乳糖苷神经酰胺的一个主要问题是，在一剂治疗后，它会导致NKT无应答(无反应性)，这是由于α-半乳糖苷神经酰胺可以被外周血液中表达CD1d的B细胞呈递(图1A)，并且在没有合适的共刺激分子的情况下刺激NKT细胞。

为了解决可溶性α-半乳糖苷神经酰胺诱导的无反应性，Dhodapkar和Steinmann研究出一种细胞治疗方法(图1B)，通过静脉内注射用α-半乳糖苷神经酰胺脉冲的，由患者的外周血单核细胞离体产生的树突细胞。这种细胞治疗方法避免了NKT无反应机制，并且对诱发癌症患者的肿瘤特异性抗原CD8应答具有很强的功效。但是，细胞疗法花费高昂，并且由于病毒感染患者的组织并不符合GMP程序，所以对他们来说细胞疗法非常不切实际。因此，需要新的方法来在体内重复且有效地刺激NKT细胞。

纳米粒子制备的α-半乳糖苷神经酰胺克服了NKT的无反应性。基于上述进展，本发明人假设包装在纳米粒子中的α-半乳糖苷神经酰胺优先被树突细胞摄取，然后释放到溶酶体中(图1C)。α-半乳糖苷神经酰胺加载到溶酶体的抗原提呈分子CD1d(非MHC抗原提呈分子)上，然后再循环到细胞表面，从而激活NKT细胞。本发明的技术通过化学合成，将α-半乳糖苷神经酰胺结合到多聚体基纳米粒子表面。

利用α-半乳糖苷神经酰胺的表面结合而不是封装方法的基本原理。可以考虑两种将α-半乳糖苷神经酰胺加载到纳米粒子的方法：1)表面覆盖，也就是首先合成纳米粒子，然后将α-半乳糖苷神经酰胺结合到纳米粒子的表面；2)直接封装方法，也就是将α-半乳糖苷神经酰胺和多聚体混合到一起，并形成纳米粒子，同时α-半乳糖苷神经酰胺均匀分布在该纳米粒子内。由于NKT细胞的生物学行为，即对应α-半乳糖苷神经酰胺药品的细胞类型，本发明人决定采用前一种方法。

如图2所示，NKT细胞的激活包括增殖、收缩和记忆阶段。在增殖阶段中，NKT细胞产生抗肿瘤和抗病毒的细胞因子。在收缩和记忆阶段中，大多数NTK细胞死亡，而只有5-10％的“记忆”NKT细胞开始“休眠”，并且重新规划自身用于下次刺激。因此，α-半乳糖苷神经酰胺的连续释放不会有效地激活NKT细胞，结果表明，α-半乳糖苷神经酰胺的连续释放反而会造成NKT细胞的免疫无应答(无反应性)。根据上述机制，本发明人设计了表面覆盖的方法，所述方法使α-半乳糖苷神经酰胺在被树突细胞和巨噬细胞吞噬后迅速释放到血清中，而不是使α-半乳糖苷神经酰胺稳定地释放。相比之下，众所周知封装方法适合长期连续的释放封装的药物。封装的纳米粒子静脉内注射后聚集在肝脏或脾脏，封装药物的稳定释放可以持续长达10天的时间。因此，封装方法并不适于释放NKT配体目的。

选择生物降解多聚体基纳米粒子的基本原理。如PLGA的多聚体具有良好的生物适合性、生物降解性及商业实用性，并且早先申请中的多聚体还可以送递药物，例如蛋白、肽疫苗和疏水性抗癌药物。