[发明专利]将由A蛋白或A蛋白的A至E结构域中的至少一个结构域所组成的蛋白质结合到基材上的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种将由A蛋白或A蛋白的A至E结构域中的至少一个结构域所组成的蛋白质结合到基材上的方法。

背景技术

A蛋白(Protein A)是构成金黄色葡萄球菌(Stanphylococcus aureus)细胞壁的5％的蛋白质，并被缩写为“SpA”。A蛋白由A至E五个结构域所组成，并且不含有半胱氨酸。

由A蛋白或A至E结构域中的至少一个结构域所组成的蛋白质(下文称之为“SpA蛋白质”)具有能够结合抗体的性质。利用此性质，SpA蛋白质被用于将抗体结合到基材上。

根据现有技术，胺偶联(amine-coupling)方法将SpA蛋白质中所含的赖氨酸残基结合至基材的羧基基团上。

引用文献列表

专利文献

PTL 1：日本公开Patent Publication No.2006-170617

非专利文献

NPTL 1：J.Bio化学式84，1475-1483(1997)

发明概述

用现有技术固定的SpA蛋白质在基材表面上具有较低的密度，这是由于SpA蛋白质具有多个赖氨酸残基并且在基材表面上不具有定向(orientation)。

附带提及的是，根据已知的方法，R-SH(R表示烃基)被吸附在金基材的表面上，以形成由化学式Au-S-R所表示的定向的膜。为了用该方法将SpA蛋白质结合至金基材上，认为半胱氨酸被结合至SpA蛋白质的末端。

然而，当用半胱氨酸(NH₂-CH(COOH)CH₂-SH)修饰SpA蛋白质的C末端时，在含有SpA蛋白质的溶液中引起SpA蛋白质的二聚化。如下式(I)所示，半胱氨酸中的巯基基团(-SH)彼此聚合，从而形成二硫键。

(其中，SpA表示SpA蛋白质。)

所述二聚化抑制了SpA蛋白质在基材上的固定。

本发明人发现，具有用含半胱氨酸的SEQ ID：1(SFNRNEC)修饰的C末端的SpA蛋白质，高度定向地固定在基材表面上。

本发明的目的是提供高密度地不引起二聚化地将SpA蛋白质固定在基材表面上的方法。

发明内容

下述方法解决了上述问题。

[1]：用于将蛋白质结合至基材表面上的方法，包括以下A至B的步骤：

步骤A，制备表面含有金或羧基基团的所述基材；以及

步骤B，将所述蛋白质提供至所述表面；

其中所述蛋白质由A蛋白或所述A蛋白的A至E结构域中的至少一个结构域所组成，以及

所述蛋白质包含用SEQ ID：1(SFNRNEC)所表示的氨基酸序列修饰的C末端。

[2]：如上述[1]所描述的方法，其中所述表面含有金。

[3]：如上述[1]所描述的方法，其中所述表面含有羧基基团，并且所述表面根据如下化学式III结合所述蛋白质：

(其中n代表自然数。)

[4]：如上述[1]所描述的方法，在所述步骤A和步骤B之间还依次包括下述C至D的步骤：

步骤C，将含有1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺HCl或其等价物、以及N-羟基琥珀酰亚胺的溶液提供至所述表面，以及

步骤D，将以下式IV所表示的化合物提供至所述表面，

(其中m代表自然数，X代表卤素原子。)

[5]：如上述[4]所描述的方法，其中所述式IV中的m为2至20范围内的自然数。

[6]：如上述[5]所描述的方法，其中所述式IV中的m为2。

[7]：如上述[1]所描述的方法，其中所述蛋白质由所述A蛋白的A至E结构域中的至少一个结构域所组成。

[8]：如上述[7]所描述的方法，其中所述蛋白质由所述A蛋白的D结构域所组成。

[9]：如上述[7]所描述的方法，其中所述蛋白质由所述A蛋白所组成。

[10]：一种在表面上固定有蛋白质的基材，其中：

所述基材含有金或酰胺键，

所述蛋白质由A蛋白或所述A蛋白的A至E结构域中的至少一个结构域所组成，以及

所述蛋白质包含用SEQ ID：1(SFNRNEC)所表示的氨基酸序列修饰的C末端。

[11]：如上述[10]所描述的基材，其中根据以下化学式II或III来固定所述蛋白质，