[发明专利]用于鉴定细胞表面抗原的免疫结合剂的方法

说明书

背景信息

免疫结合剂，包括抗体、其缀合物和衍生物，作为治疗剂和诊断剂在商业上是极其重要的。用于抗体制备或筛选的常规方法通常利用可溶性抗原。然而，对于某些膜结合的蛋白抗原，如果从膜上溶解抗原将改变抗原上的构象表位，从而导致抗体制备或筛选的失败。此外，免疫印迹和亲和层析法中的一个主要问题是将选择具有对抗原的中等亲和力的抗体。这允许包含许多交叉反应性或粘性抗体(sticky antibody)，从而在连续筛选方法中造成负担。虽然已将表达膜结合抗原的细胞直接用于抗体制备，但仍然缺乏能够检测和富集高亲和力的抗细胞表面抗原的抗体的高效筛选方法。

发明概述

本发明提供了用于鉴定能够特异性结合细胞表面抗原的免疫结合剂例如scFv抗体的方法。本发明的方法通常包括将标记的表达抗原的细胞与标记的表达免疫结合剂的细胞接触，然后使用细胞分选仪分离结合表达抗原的细胞的表达免疫结合剂的细胞。此类方法对于快速且高效地鉴定抗存在于膜内在蛋白(integral membrane protein)例如GPCR中的构象表位的免疫结合剂是特别有用的。本发明还提供了使用本发明的方法鉴定的分离的免疫结合剂和编码免疫结合剂的核酸。

在一个方面，本发明提供了用于鉴定特异性结合目的细胞表面抗原的免疫结合剂的方法。该方法包括：提供多个可操作地连接第一可分选标记的表达免疫结合剂的细胞；提供多个可操作地连接至第二可分选标记的表达抗原的细胞，其中目的抗原展示在表达抗原的细胞的表面；将表达抗原的细胞与表达免疫结合剂的细胞接触；和使用细胞分选器(例如，荧光激活细胞分选器)从多个表达免疫结合剂的细胞分离一个或多个可特异性结合表达抗原的细胞的表达免疫结合剂的细胞，其中单个细胞复合物(例如，抗原与B细胞受体之间形成的复合物)中第一和第二可分选标记的存在标示着表达免疫结合剂的细胞与表达抗原的细胞的结合，从而鉴定了结合目的抗原的免疫结合剂。

在一些实施方案中，克隆性地分离分离的表达免疫结合剂的细胞。在一些实施方案中，将表达免疫结合剂的细胞经历克隆扩增(clonal expansion)。在其他实施方案中，从表达免疫结合剂的细胞分离编码免疫结合剂的核酸序列。用于分离编码免疫结合剂的核酸序列的适当方法包PCR，例如单细胞PCR。可在克隆性分离细胞后和/或克隆扩增后分离编码免疫结合剂的核酸序列。

在一些实施方案中，将使用本发明的方法分离的表达免疫结合剂的细胞经历基于细胞的测定以在功能上表征免疫结合剂。适当的基于细胞的测定包括CELISA。

在一些实施方案中，免疫结合剂是抗体。此类抗体包括小鼠抗体、兔子抗体、兔源化(rabbitized)抗体、鸡抗体、骆驼抗体、骆驼源化(camelized)抗体、人抗体、人源化抗体和嵌合抗体。适当的抗体形式包括但不限于Fab、Dab、纳米抗体(Nanobody)和scFv。

在一些实施方案中，从外源基因表达目的抗原。在其他实施方案中，目的抗原是经遗传工程改造的抗原。在其他实施方案中，目的抗原是膜内在蛋白。适当的膜内在蛋白包括但不限于GPCR(例如，CXCR2)或离子通道。

在一些实施方案中，第一或第二可分选标记是荧光标记。适当的荧光标记包括但不限于荧光蛋白质、抗体/荧光缀合物(fluor conjugate)和荧光细胞标记。

在一些实施方案中，表达抗原的细胞是酵母或哺乳动物细胞(例如，人细胞)。在一些实施方案中，表达抗原的细胞表达外源抗原。在一些实施方案中，用表达载体转染表达抗原的细胞。

在一些实施方案中，表达免疫结合剂的细胞是酵母或哺乳动物细胞。适当的哺乳动物细胞包括但不限于B细胞，例如兔B细胞。在一些实施方案中，从经免疫的动物例如通过DNA接种免疫的动物分离B细胞。在一些实施方案中，表达免疫结合剂的细胞包含从表达载体表达的免疫结合剂。

在另一个方面中，本发明提供了编码通过本发明的方法鉴定的免疫结合剂的分离的核酸分子。

在另一个方面中，本发明提供了产生能够结合目的抗原的免疫结合剂的方法，其包括将通过本发明的方法鉴定的编码免疫结合剂的核酸序列引入表达环境以便产生编码的免疫结合剂。

在另一个方面中，本发明提供了由本发明的方法产生的免疫结合剂。