[发明专利]全部流感嗜血杆菌的测定方法

说明书

技术领域

本发明涉及特异性地测定所有流感嗜血杆菌的方法、以及用于该方法的测定装置。

背景技术

已知流感嗜血杆菌(HaemoPhilus influenzae)与肺炎球菌同样作为人鼻咽腔的常居菌，并已知对于没有达到常居化的、尤其是婴幼儿、小儿而言是呼吸道感染、中耳炎、髓膜炎、败血症等的病原菌。与其它感染疾病的病原菌同样，对于流感嗜血杆菌而言，多用抗菌药导致的耐药性作为导致症状的难治、重症化的原因而成为问题，治疗开始时的适当的抗菌药选择的重要性正在增加。作为感染疾病治疗的原则，尽可能早期确定病原菌，并选择确切的治疗对预后的改善、医疗成本的削减、防止出现耐药菌很重要，因此需要迅速检测来自流感嗜血杆菌的共同抗原的诊断试剂。

现在，作为流感嗜血杆菌判定方法使用革兰氏染色法、镜检、培养法、利用菌体的酶代谢的显色反应、乳胶凝集法、PCR法等。其中，作为迅速诊断方法有利用乳胶凝集法的流感嗜血杆菌抗原检测试剂盒(Slidex Meningite-Kit 5.bioMerieux公司)，但这是检测b型流感嗜血杆菌的多糖体抗原的方法，不能用于无荚膜型的判定。另外，也有采用PCR法的流感嗜血杆菌基因检测测定法、以菌株共同抗原的P6、P4抗原作为靶的这些基因检测测定法，但采用PCR法的基因诊断测定法由于实施设备受限而目前缺乏普遍性。另外，有关于P6抗原的单克隆抗体的报告，是通过免疫印迹法检测流感嗜血杆菌(非专利文献1)。但是，采用该方法的灵敏度低，不是作为临床检查使用的水平。

流感嗜血杆菌是革兰氏阴性杆菌，根据覆盖菌的荚膜的有无大致分为荚膜型和无荚膜型，进一步按照存在于荚膜的多糖抗原的结构差异导致的血清类型分类，荚膜型存在a～f型，另外，无荚膜型被分类为不能区分类型的型。作为b型荚膜多糖的多核糖基核糖醇磷酸盐被报告是b型特异性抗原，但是在无荚膜型中还没发现作为这样的特异抗原的多糖。另外，作为无荚膜型的蛋白抗原已知作为流感嗜血杆菌的主要抗原的、菌体外膜蛋白质之一的P2蛋白质，由于本抗原多发变异，已知根据菌株而抗原性不同。

非专利文献

非专利文献1：Journal of Clinical Microbiology.(1989)2263-2267

发明内容

如上所述，没有发现流感嗜血杆菌的共同抗原，没有能够同时检测全部流感嗜血杆菌的免疫学的方法。

本发明的课题是解决上述问题，将提供能够以高灵敏度同时检测全部的流感嗜血杆菌的免疫学测定方法、以及利用该方法的测定装置作为课题。

本发明的发明人，为了解决上述课题而进行深入研究的结果，关注了以往被认为流感嗜血杆菌中共同存在并且变异比较少的P4和P6蛋白。该蛋白质相比于其它抗原在流感嗜血杆菌中表达量少，因而认为即使制作了识别抗体也难以高灵敏度地、且全面性地测定全部类型的流感嗜血杆菌。另外，存在很多具有与P4和P6蛋白同源性高的蛋白的细菌，因此认为难以特异性地检测流感嗜血杆菌。但是，与预想相反，本发明的发明人能够制作高选择性地进行识别的抗体。另外，确认了该抗体很难受到具有测定时容易混入的可能性的绿脓杆菌、大肠杆菌等的影响。本发明是基于本成果而完成的发明。

即，本发明提供一种全部流感嗜血杆菌的免疫学测定方法，其特征在于，使用流感嗜血杆菌的P4抗原识别抗体或P6抗原识别抗体。

另外本发明还提供一种全部流感嗜血杆菌的免疫学测定装置，其特征在于，含有流感嗜血杆菌的P4抗原识别抗体或P6抗原识别抗体。

根据本发明，通过以所有流感嗜血杆菌为对象的高灵敏度测定方法的确立，使该测定装置的提供成为可能，由此使得在中耳炎等中感染的所有流感嗜血杆菌的检测能够简便、迅速地进行。本发明方法对由流感嗜血杆菌导致的中耳炎的检测特别有用。

附图说明

图1表示ELISA中的、对于抗P4PoAb(a)和抗P6PoAb(b)的免疫原的流感嗜血杆菌共同抗原(P6、P4)的反应性。

图2表示ELISA中的、对于抗P6PoAb的NTHiP6(a)和NTHi破碎菌体(b)的反应性。

图3表示ELISA中的、对于抗P6PoAb的细菌类(表1)的反应性。

图4表示ELISA中的、对于抗P4PoAb的P4rec.(a)和NTHi菌体提取液(b)的反应性。

图5表示ELISA中的、对于抗P4PoAb的细菌类(表1)的反应性。

图6表示免疫层析的一般性结构。

图7表示免疫层析停止时的检测体的展开状态。