[发明专利]普洱茶微生物菌群中的优势真菌及其谱图

权利要求书

1.一种普洱茶渥堆发酵过程中优势真菌菌群的分子鉴定方法，包括以下步骤：

1)取渥堆发酵过程中不同翻堆次数和位置的普洱茶作为待测样品；

2)提取待测样品的总DNA，并对其进行纯化；

3)以待测样品的总DNA为模板，在专用引物——第一步扩增采用的引物为GeoA2：5′CCAGTAGTCATATGCTTGTCTC-3′和Geo11：5′-ACCTTGTTACGACTTTTACTTCC-3′；第二步扩增采用的引物为：NS31-GC：5’-CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGTTGGAGGGCAAGTCTGGTGCC-3’和Glol：5’GCCTGCTTTAAACACTCTA-3’的引导下进行PCR扩增，扩增结束后，对目的片段进行回收及纯化；

4)对纯化的目的片段进行变性梯度凝胶电泳，染色后得到DGGE指纹图谱；

5)从凝胶中回收优势条带，并以此为模板，用上游引物GeoA2：5′-CCAGTAGTCATATGCTTGTCTC-3′和；下游引物Geo11：5′-ACCTTGTTACGACTTTTACTTCC-3′，组成的专用引物的引导下进行PCR扩增，扩增结束后，对目的片段进行回收、纯化及测序；

6)步骤5的测序结果和标准菌群的序列进行比对，确定渥堆发酵普洱茶的优势真菌菌群。

2.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于，所述步骤2)的DNA提取采用试剂盒法，具体的操作步骤为：取5g茶叶样品，使用液氮冷冻研磨3次，转移到2ml离心管中，加入200mg玻璃珠，使用Omega soil DNA提取试剂盒对处理好的茶叶样品进行提取，加入600ul SLX溶液，高速振荡10min混合均匀，70度水浴10min，期间混合样品数次，加入200ul SP2溶液，混合均匀，冰浴5min，13000g离心5min，上清转移到一个新的离心管中，加入0.7倍异丙醇，颠倒混匀，13000g离心10min，弃去上清，倒置于吸水纸上干燥，加入200ul elution buffer到离心管中，混匀，65度水浴20min溶解DNA，加入50ul HTR溶液，混合均匀，室温放置2min，13000g离心2min，将上清转移到一个新的离心管中，如果上清依旧带有深色物质重复加入HTR溶液处理，加入等体积的XP2溶液，充分混合均匀，之后将所有溶液转移到HiBind DNA柱子中，10000g离心1min，弃去流出液重新使用收集管，加入300ul XP2溶液，10000g离心1min，弃去流出液和收集管，把柱子放入一个新的收集管中，加入700ul经无水乙醇稀释过的SPW wash溶液，10000g离心1min，弃去流出液重新使用收集管，再用700ul SPW wash溶液洗一次，弃去液体，把柱子插入空的收集管中，13000g离心2min，将柱子放入50度烘箱30min，把柱子放到一个新的离心管中，加入50ul elution buffer到柱子中心，65度水浴10min，13000g离心1min，将离心洗脱液重新加入柱子中，65度水浴10min，13000g离心2min，所得洗脱液取5ul电泳检测。

3.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于，所述步骤3)中的PCR扩增条件为巢式PCR扩增：先加入扩增18S rDNA全长的引物和反应体系进行第一步扩增，PCR反应条件为：94℃预变性4min，然后在94℃变性45s，50℃-55℃引物复性45s，72℃引物延伸1.5min，循环30次，72℃终延伸10min，取其产物进行100倍稀释后作为模板，以18S rDNA为目标进行扩增，PCR反应条件为：94℃预变性4min，然后在94℃变性45s，50-55℃引物复性45s，72℃引物延伸1min，循环30-35次，72℃终延伸10min。

4.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于，所述步骤4)中的染色液为sybrgreen，浓度为1∶10000稀释原液，1×TAE缓冲液，染色时间为20-40min，得DGGE图谱。

5.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于，所述步骤4)中的DGGE电泳分离，电泳条件为：使用Bio-Rad公司的Dcode基因突变检测系统在80-120V，60℃下电泳8-14h，变性胶为聚丙烯酰胺凝胶，含有尿素和甲酰胺等变性剂，变性剂浓度范围为从35％到60％，胶浓度为8-10％。