[发明专利]溶解血小板栓块的基因工程制剂的制备方法及其应用

权利要求书

1.一种溶解血小板栓块的基因工程制剂的制备方法，其特征在于该方法包括：

a）人源性抗体A11工程菌的构建

将从噬菌体抗体文库中获得的能特异性识别血小板整合素β3亚基第49-66表位的噬菌体-A11基因用限制性内切酶Noc I 和Not I双酶切后插入到表达质粒pET29a中，构建成重组质粒pET29a-A11；将重组后的表达质粒pET29a-A11转化宿主菌BL21(DE3) pLysS获得能稳定分泌人源性抗体A11工程菌；

b）解整合素金属蛋白酶-18羧基端重组蛋白AD18C工程菌的构建

通过多聚酶链式反应法，扩增人源性解整合素金属蛋白酶18蛋白羧基端基因；通过限制性内切酶Nde I 和Not I双酶切后插入到表达质粒pGEX-4T2中，构建成重组质粒pGEX-4T2-AD18C_840-1221；将重组后的表达质粒pGEX-4T2-AD18C_840-1221转化宿主菌BL21(DE3) pLysS获得能稳定分泌人源性重组蛋白AD18C工程菌；

c）制备溶解血小板栓块的基因工程制剂

ⅰ）将步骤a）或步骤b）中的人源性抗体A11或人源性重组蛋白AD18C工程菌于LB培养基中37℃培养过夜，按1:50比例转接后继续培养至光密度值OD_600nm≈0.6，加1mM 异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导4个小时进行诱导表达，获得含目的蛋白的菌体；将已知重量的菌体，按10ml/g湿重比例加入裂解液，搅拌均匀，于4℃进行超声破菌，12000 r/min离心30min获得包涵体；其中：裂解液为：100mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、2mmol/L乙二胺四乙酸、100 mM/L氯化钠， pH 7.0；

ⅱ）将步骤ⅰ）的包涵体进行复性处理，取包涵体悬浮在9倍体积的洗涤缓冲液中，洗涤3次；取洗涤后的湿包涵体按10mL/g比例加入变性缓冲液，37℃变性3h，4℃，8000r/min离心30min，取上清，按1/40比例逐步稀释到含有不同浓度的盐酸胍、氯化钠、尿素、氧化型谷胱甘肽、还原型谷胱甘肽的复性缓冲液中，4℃搅拌30 min后，静置18 h获得包涵体复性产物上清液；其中：洗涤缓冲液为：100 mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，2 mmol/L乙二胺四乙酸盐，0.005/L Triton，2 mol/L 尿素，pH7.0；变性缓冲液为：50 mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，6 mmol/L盐酸胍，5 mmol/L 乙二胺四乙酸盐，100 mmol/L 巯基乙醇，pH8.0；

ⅲ）将步骤ⅱ）的包涵体复性产物上清液通过Ni-NTA亲和柱（A11）或谷胱甘肽-S-转移酶（GST）亲和柱（AD18C）进行纯化，获得溶解血小板栓块的基因工程制剂，该制剂为基因工程抗体或重组蛋白。

2.根据权利要求1所述的溶解血小板栓块的基因工程制剂，其特征在于所述重组蛋白免疫新西兰大白兔，获得兔源性抗AD18C多克隆抗体。

3.一种权利要求1制备的溶解血小板栓块的基因工程制剂的应用，其特征在于用于脑血管栓塞或心血管栓塞的治疗。

4.一种权利要求2所述兔源性抗AD18C多克隆抗体的应用，其特征在于用于动脉血管出血的治疗及动脉血栓的监测。

5.根据权利要求1所述的溶解血小板栓块的基因工程制剂，其特征在于所述人源性抗体A11的脱氧核苷酸序列。