[发明专利]阳离子化多糖纳米粒基因传递系统及其制法

权利要求书

1.一种阳离子化多糖纳米粒基因递送系统，其特征是：它是一种用胺类化合物修饰的阳离子化多糖结合DNA质粒的基因传递系统，其中按质量比计，阳离子化多糖:DNA质粒为=0.5~200:1，阳离子化多糖-DNA质粒纳米复合物的粒径为21-414nm，所述的胺类化合物为精胺、乙二胺或数均分子量为600Da-2000Da的聚乙烯亚胺。

2.一种制备权利要求1所述的阳离子化多糖纳米粒基因传递系统的方法，其特征是包括以下步骤：

步骤1.阳离子化多糖的制备：

A. 氧化多糖的制备：

取0.2~1g精制多糖，溶解于20~100ml双蒸水中，加入0.1~4g KIO₄，迅速放到暗室，磁力搅拌，室温反应72h；反应液加入1~20ml 乙二醇终止反应，按前述条件继续反应30min；将反应液装入透析袋，在双蒸水中透析48h；透析液冻干，得到氧化多糖0.1~1.5g；

B. 阳离子化多糖的制备：

1) 精胺修饰的阳离子化多糖的制备：

取0.1~0.5g A步骤制得的氧化多糖，溶解于10~50ml 双蒸水中；称取精胺溶解于5ml的硼酸盐缓冲液（pH=9），精胺与氧化多糖的醛基的摩尔比为0.5~5:1；将含有精胺的硼酸盐溶液缓慢加入到多糖溶液中，同时进行磁力搅拌；加完之后，磁力搅拌，室温反应24h；之后，向反应液中加入0.1~1g 硼氢化钠，相同条件下继续反应48h；再向反应液中加入0.1~1g 硼氢化钠，加入硼氢化钠的总质量与氧化多糖的质量之比为：0.5~4:1，相同条件下继续反应24h；将反应液装入透析袋（截取分子量>3500Da），在双蒸水中透析48h；透析液冻干，得到精胺修饰的阳离子化多糖0.1~0.8g；

2）乙二胺修饰的多糖的制备

取0.1~0.5g A步骤制得的氧化多糖，溶解于10~30ml 双蒸水中；取0.1~2ml乙二胺溶解于5ml的硼酸盐缓冲液（pH=9），乙二胺与氧化多糖的醛基的摩尔比为0.5~5:1；将含有乙二胺的硼酸盐溶液缓慢滴加入多糖溶液中，同时进行磁力搅拌；加完之后，磁力搅拌，室温反应24h；然后，向反应液中加入0.1~1.0g 硼氢化钠，相同条件下继续反应48h；再向反应液中加入0.1~1.0g 硼氢化钠，加入硼氢化钠的总质量与氧化多糖的质量之比为：0.5~4:1，相同条件下继续反应24h；将反应液装入透析袋（截取分子量>3500Da），在双蒸水中透析48h；透析液冻干，得到乙二胺修饰的阳离子化多糖0.1~0.7g；

3）小分子量聚乙烯亚胺修饰的多糖的制备

取0.1~1g精制多糖，溶于5~20ml磷酸盐缓冲液（pH=7）；将活化羟基的连接剂，如：N，N’-羰基二咪唑、苯并三唑碳酸酯、羰基咪唑、N,N’-二琥珀酰亚胺基硫酸酯中的任一种，溶解于5ml二氯甲烷中，多糖与连接剂的质量比为：0.5~4:1，在氮气的保护下，首先在多糖液中加入催化剂三乙胺，再将羟基连接剂的二氯甲烷溶液缓慢加入多糖溶液中，匀速搅拌，在20~100min内加完，加完之后，室温反应90~150min，获得活化的多糖溶液；将数均分子量为600-2000Da的聚乙烯亚胺（PEI）溶于1-20ml磷酸盐缓冲液中，PEI与多糖的摩尔比为：0.5~4:1，加入催化剂三乙胺，在避光、氮气保护、室温条件下缓慢加入到活化的多糖溶液中，在90~150min内加完，避光、室温下反应10h，整个反应在匀速搅拌下进行；反应完成之后的溶液经透析（截取分子量>3500Da）、冻干之后，得到PEI 修饰的多糖；

步骤2.分别配制浓度为0.01~10mg/ml的三种阳离子化多糖水溶液，取10~20μl阳离子多糖水溶液和10~20μl 含0.1~2μg DNA质粒溶液，分别在55℃加热30~60min；立即混合，涡旋10~60s，即得到阳离子化多糖-DNA质粒纳米复合物的基因传递系统。