[发明专利]阪崎肠杆菌的环介导等温扩增检测引物组、检测方法和检测试剂盒

说明书

技术领域：

本发明涉及一种基于环介导等温扩增(loop-mediated isothermalamplification，LAMP)技术的病原菌快速检测技术，特别涉及对阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)特定基因ompA基因的片段具有特异性的检测引物组，将所述检测引物组用环介导等温扩增法LAMP检测阪崎肠杆菌的检测方法和检测试剂盒。

背景技术：

阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)是肠杆菌科肠杆菌属的一种革兰阴性无芽孢杆菌，1980年前称为黄色阴沟肠杆菌，1980后更名为阪崎肠杆菌。1961年，Franklin等首次报道了2例由阪崎肠杆菌引起的婴儿脑膜炎病例，随后在全球范围内相继报道了一系列新生儿阪崎肠杆菌感染事件。阪崎肠杆菌能引起严重的新生儿脑膜炎、小肠结肠炎和菌血症，并且可引起神经系统后遗症和死亡，该菌感染引起的死亡率高达20％-50％。尽管现在还不能确定阪崎肠杆菌的宿主和传播模型，但在一些新生儿阪崎肠杆菌感染事件的调查中，发现婴幼儿配方粉是主要的感染渠道。2004年FAO/WTO在日内瓦召开的专家咨询会上将阪崎肠杆菌列为导致婴儿感染疾病和死亡的“A”类微生物范围。

在阪崎肠杆菌的检测技术方面，除传统生化方法外，新修订的国家标准GB4789.40-2010增加了显色培养基作为分离鉴定的一个方法，但仍需要进一步生化鉴定。随着分子生物学技术的发展，分子检测方法如PCR、荧光定量PCR技术等亦逐步应用于阪崎肠杆菌快速检测，然而这些技术也存有一定局限性，如需要昂贵仪器，操作复杂，不易推广使用等缺点。目前，仍然缺乏一套较为系统的快速检测方法。

LAMP技术是2000年Notomi等开发的一种新型核酸扩增技术，针对待测靶基因的6个区域设计4-6条特异性引物，在BstDNA聚合酶的作用下，在65℃左右等温条件1h内可以进行特异高效快速的核酸扩增，达到10⁹拷贝，扩增结果可直接观察焦磷酸镁沉淀或者加入显色剂进行判断。LAMP方法与PCR技术相比，检测时间短，具有更高的灵敏度，操作简单，仅仅需要普通水浴锅就可以完成检测。近年来已广泛用于疾病预防和病原检测等方面。

发明内容：

本发明的第一个目的在于提供一种应用环介导等温扩增检测阪崎肠杆菌的检测引物组，该检测引物组对阪崎肠杆菌的ompA基因具有特异性。

该检测阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)的检测引物组由下列引物组成：

上游外引物为F3(5’-3’)：CCGTGAACTTTTCCCAAGGA

下游外引物B3(5’-3’)：GTGGAACTGGGACCAACC

上游内引物FIP(5’-3’)：ACTGCAATCGCGATAGCTGTCTAGCGCATGGCCTTTTTGG

下游内引物BIP(5’-3’)：GCACTGGCTGGCTTCGCTACGTTTGCCACCTGCGTACC。

本发明的第二个目的是提供一种阪崎肠杆菌的检测方法，其特征在于，以阪崎肠杆菌的ompA基因为靶基因，通过LAMP方法用上述检测引物组对样品中的菌体的DNA选择性扩增所述的靶基因ompA的特定片段，确认是否存在有扩增产物。

所述的样品优选为奶粉。

所述的检测方法具体优选为：

(1)样品的制备和模板的提取：将待检样品用阪崎肠杆菌的增菌液增菌培养，提取培养液中菌体的DNA作为模板；

(2)环介导等温扩增LAMP：将扩增反应体系于65℃孵育45～60min，80℃终止反应1～2min；

所述的扩增反应体系包括：1×Thermopol反应缓冲液、1.4-1.8mmol/L dNTP s、4-8mmol/L硫酸镁(MgSO₄)、0.15-0.25μmol/L上游外引物F3、0.15-0.25μmol/L下游外引物B3，1.2-2μmol/L上游内引物FIP、1.2-2μmol/L下游内引物BIP、0.8-1mol/L甜菜碱、0.24-0.32U/μL的Bst DNA聚合酶和适量步骤(1)得到的模板DNA，余量为水；

(3)LAMP反应产物的检测：

利用电泳检测、荧光检测或浊度检测LAMP反应产物是否具有扩增产物。

所述的荧光检测是在反应管中加入SYBR Green I显色剂，1～5min后观察结果，如颜色为橙色，则待检测样品阪崎肠杆菌阴性，如颜色为绿色，则待检测样品阪崎肠杆菌阳性，含有阪崎肠杆菌。