[发明专利]一种应用5-氟胞嘧啶实时监测HIV-1病毒DNA脱胺基化过程的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种监测DNA脱胺基化过程的方法，具体说，是涉及一种应用5-氟胞嘧啶实时监测HIV-1病毒DNA被人源胞嘧啶蛋白脱胺基化过程的方法。

背景技术

研究表明：HIV-1病毒通过其cDNA在人体内复制而感染人体，人体利用自身的免疫功能保护机体不受感染；人免疫系统DNA胞嘧啶脱胺基化蛋白APOBEC3G，其在脾脏、睾丸、卵巢、血液的白细胞如T-淋巴细胞及巨噬细胞中大量表达，该蛋白可以抑制病毒感染因子Vif蛋白缺失的HIV-1病毒感染，具体机理为：APOBEC3G蛋白可以特异性地脱胺基化HIV-1病毒基因在人体中刚合成的最小cDNA片段5’-CCC-3’中3’端的两个胞嘧啶，变为尿嘧啶，这种脱胺基化修饰可以诱导人体内尿嘧啶DNA糖基化酶(全称：uracil DNAglycosylase，简称UDG)进一步降解病毒DNA最小片段，从而达到阻止病毒复制的目的(Nucleic Acids Res.2004，32：2421-2429；Nat.Struct.Mol.Biol.2004，11：435-442；Science.2003，300：1112；Cell.2003，113，803-809；Nature.2003，424：99-103；Nature.2003，424：94-98)。因此，研究一种可实时监测DNA被相应蛋白脱胺基化过程的方法，可为研究脱胺基化蛋白的酶活性提供一种新途径，尤其是，可为研究抑制HIV-1病毒感染的方法提供一种便捷手段。

但现有研究表明：人源胞嘧啶蛋白脱胺基化的反应过程非常快，不易监测。虽然核磁共振(Nucleic magnetic resonance，NMR)技术是检测蛋白质与其它分子相互作用最有力最直接的技术手段之一，且¹H-NMR信号的灵敏度很高，但氢谱在复杂的生理条件下不能排除体系中其它分子中原子信号的干扰，存在信号重叠和监测不方便等缺陷。

由于¹⁹F-NMR具有接近¹H-NMR信号灵敏度83％的高灵敏度，能够在复杂的生理条件下排除体系中其它分子中原子信号的干扰。因此，本发明通过将19F原子引入到碱基胞嘧啶芳环的5位，首次提供了一种5-氟胞嘧啶在体外实时监测HIV-1病毒DNA被人源胞嘧啶蛋白脱胺基化过程中的应用，解决了现有技术中的上述缺陷。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种应用5-氟胞嘧啶实时监测HIV-1病毒DNA被人源胞嘧啶蛋白脱胺基化过程的方法，以克服人源胞嘧啶蛋白脱胺基化病毒基因胞嘧啶的反应过程非常快，不易监测及利用氢谱监测存在信号重叠和监测不方便等缺陷，为抑制HIV-1病毒感染的研究提供一种便捷手段。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种应用5-氟胞嘧啶实时监测HIV-1病毒DNA脱胺基化过程的方法，是首先通过固相合成方法将5-氟胞嘧啶前体引入HIV-1病毒单链DNA序列中，合成含有5-氟胞嘧啶的DNA序列，然后将合成的DNA序列与人源胞嘧啶蛋白质混合，通过F谱信号的变化，监测DNA脱胺基化的反应过程。

所述的5-氟胞嘧啶前体是4-(2，4，6-三甲基苯氧基)-5-氟尿嘧啶衍生物；对于此衍生物，可以参考文献J.Org.Chem.1992，57，2989-2991中所述的合成方法进行制备；也可以通过如下合成方法得到该化合物：以5-氟尿嘧啶为原料，利用乙酰基保护羟基，然后在三氯氧磷的作用下与2，4，6-三甲基苯酚作用，得到4位被2，4，6-三甲基苯氧基保护的5-氟尿嘧啶，然后脱除羟基上乙酰基的保护，通过常用的方法将羟基分别和4，4’-二甲氧基三苯基甲基氯及N，N-二异丙基乙胺-2-氰基乙基-N，N，N’，N’-四异丙亚磷酰胺作用，得到4-(2，4，6-三甲基苯氧基)-5-氟尿嘧啶衍生物。

在上述基础上，应用5-氟胞嘧啶实时监测HIV-1病毒DNA脱胺基化过程的方法，是首先通过固相合成方法将4-(2，4，6-三甲基苯氧基)-5-氟尿嘧啶衍生物引入HIV-1病毒单链DNA的碱基序列中，合成带有4-(2，4，6-三甲基苯氧基)-5-氟尿嘧啶结构的HIV-1病毒DNA，然后将所述的2，4，6-三甲基苯氧基转化为胺基，得到包含两个5-氟胞嘧啶的HIV-1病毒DNA；将人源胞嘧啶蛋白与前述得到的包含两个5-氟胞嘧啶的HIV-1病毒DNA混合，每1～10分钟采集一次一维¹⁹F-NMR谱图，以实时监测HIV-1病毒DNA被人源胞嘧啶蛋白脱胺基化的过程。