[发明专利]β-银环蛇毒素检测试剂盒及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物学免疫方法的测定技术领域，特别是涉及一种以胶体金免疫层析法快速检测β-银环蛇毒素检测试剂盒及其制备方法。

背景技术

银环蛇(Bungarus multicinctus)属动物界，脊索动物门，爬虫纲，有鳞目，眼镜蛇科，环蛇属。全身背面是黑白相间的环纹，具30～50个白色或乳黄色窄横纹，是世界十大毒蛇之一。属前沟牙类毒蛇，其一次排毒46mg，1mg干毒就能致人于死地。毒腺分泌的蛇毒含多种多肽成分，具有不同的生物学活性。随着捕食者和被捕者的相互作用，毒素随之进化，功能性的生理活性发生相应的变化。银环蛇毒素的主要成分为蛋白质和多肽，包括α-银环蛇毒素(α-BGT)、β-银环蛇毒素(α-BGT)、κ-银环蛇毒素(κ-BGT)、γ-银环蛇毒素(γ-BGT)和磷脂酶A等酶类。

β-银环蛇毒素(A链分子量为13500，B链分子量为7000)，由于可抑制神经末梢小体释放传递物质，所以影响突触传导。β-银环蛇毒素具有强烈的磷酸酶A2活性，但只有在有钙离子存在的条件下才显活性。β-银环蛇毒素主要用于医学药理学和分子免疫学，制备单克隆抗体，在蛇毒的检测、蛇咬伤中毒的预防和救治等方面具有重要意义。

测定蛇毒素有多种方法，例如：生物质谱法、光学免疫分析、荧光免疫技术等，但由于不能够适应各种不同的环境而受到很大限制。传统的酶联免疫吸附法(ELISA)需要酶联仪等设备，在野外运用受到很大限制。本发明介绍了一种以胶体金免疫层析法快速检测β-银环蛇毒素的检测试剂盒及其制备方法，该方法具有简单、快速，无需任何仪器设备，经济实用等特点，适用于快速定性检测样本中是否含有β-银环蛇毒素。

胶体金免疫层析技术是20世纪九十年代以来在单克隆抗体技术、免疫层析技术及胶体金显色技术基础上发展起来的一项新型体外诊断技术。基于胶体金免疫层析技术可以制备胶体金试纸，胶体金试纸的原理是应用胶体金标记技术，以胶体金为示踪物，利用抗原抗体特异性结合反应，利用特定的显色反应在试纸上的显色而判定检测的结果，具有操作简单、检测快速、灵敏度高、特异性强，无须复杂的仪器等特点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种简单、快捷、灵敏度高、特异性强的β-银环蛇毒素试剂盒及其制备方法，用于检测待检样本中是否含有β-银环蛇毒素。

一种用于检测β-银环蛇毒素的检测试剂盒，包括样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜、吸样垫和PVC支撑板，在PVC支撑板上依次紧密粘附有样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸样垫。所述样品垫为玻璃纤维；所述胶体金垫为胶体金标记的β-银环蛇毒素单克隆抗体聚酯膜；所述硝酸纤维素膜上依次包被有检测线(T线)和质控线(C线)，其中检测线(T线)上包被了β-银环蛇毒素单克隆抗体，质控线(C线)上包被了羊抗鼠IgG多克隆抗体；所述吸样垫为吸水纸。

本发明提供了一种β-银环蛇毒素检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

(1)制备β-银环蛇毒素单克隆抗体

采用β-银环蛇毒素为免疫原免疫BALB/C小鼠，通过杂交瘤技术，得到分泌抗β-银环蛇毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株；以体内诱生腹水法大量制备抗体，使用Protein G柱进行纯化，获得β-银环蛇毒素单克隆抗体。

(2)制备胶体金

取0.01％的氯金酸水溶液，加热煮沸。根据需要迅速加入1％枸橼酸三钠水溶液1ml，继续煮沸约5min，出现橙红色。这样制成的胶体金颗粒的大小为20-40nm。

(3)制备胶体金垫

取颗粒大小为20-40nm的胶体金溶液，用0.1mol/L K₂CO₃将胶体金溶液的pH值调至7.0-8.0，室温放置30分钟；在上述溶液中加入β-银环蛇毒素单克隆抗体，使β-银环蛇毒素单克隆抗体的浓度为15-30μg/ml胶体金，混合均匀后，室温放置30分钟；加入10％的牛血清蛋白(BSA)溶液使其浓度为10-30μl/ml，混合均匀，室温放置30分钟；12000转离心30分钟，仔细吸取上清液，弃去，剩余的沉淀用初始胶体金体积的胶体金复溶液溶解；12000转离心30分钟，仔细吸取上清液，弃去，剩余的沉淀用30％-80％初始胶体金体积的胶体金复溶液溶解，得到β-银环蛇毒素单克隆抗体-胶体金标记物；将β-银环蛇毒素单克隆抗体-胶体金标记物按1mL铺40-70cm²聚酯膜的比例均匀铺在聚酯膜上，再置干燥间，在温度38℃，湿度小于30％的条件下干燥24±2小时，制成胶体金垫。