[发明专利]石油污染土壤生物修复过程中微生物多样性的PCR-DGGE分析方法

权利要求书

1.采用的石油污染土壤生物修复过程中微生物多样性的PCR-DGGE分析方法，提取土壤样品DNA的最佳土壤样品量为0.4g，得到的DNA沉淀采用100μLTE缓冲液溶解，纯化后的DNA沉淀采用50μL TE缓冲液溶解。

2.根据权利要求1所述的DNA提取方法，其纯化后的DNA产品取1μL即可直接用于PCR反应，参考PCR程序为：起始94℃预变性5min，94℃变性45s，55℃引物复性45s，72℃引物延伸90s，25个循环，72℃终延伸10min。

3.根据权利要求2所述的PCR反应方法，取3～5μL PCR产物即可直接用于DGGE实验。

4.DGGE制胶时，宜用9μLTEMED，40μL 10％APS投加入18mL的变性丙烯酰胺胶溶液中；增大试剂用量会导致胶凝固时间快而使浓度梯度不均匀。

5.根据权利要求4所述的制胶方法，灌胶后，在顶端用保鲜膜覆盖，隔夜放置(约10h)，能获得比短时间(1～2h)更为优良的变性胶。

6.根据权利要求5所述的制胶方法，设置电压120V，电泳温度60℃，电泳时间5h，即可获得良好的DGGE图谱，较长(约12h以上)的电泳时间对电泳效果改善不明显。

7.根据权利要求6所述的电泳方法，银染时，固定时间为15min，染色时间15min，显色1～2min，每次间隔均用去离子水快速清洗两遍，终止液可以不予使用。

8.根据权利要求1～7所述的实验方法，发现少量合理的试剂用量可以大大地节约实验成本和时间，并能得到理想的实验效果。