[发明专利]一种胰岛素基因修饰的肝干细胞制法及其应用和制剂

说明书

技术领域

本发明涉及肝干细胞及其制备方法、该肝干细胞在制备糖尿病制剂中的应用、以及包括该肝干细胞的制剂。特别地，本发明涉及胰岛素基因修饰的肝干细胞的制备方法和应用，以及其胰岛素基因修饰的肝干细胞及其制备方法、该胰岛素基因修饰的肝干细胞在制备糖尿病制剂中的应用、制备该胰岛素基因修饰的肝干细胞抗原负载的肝干细胞的制剂。

背景技术

目前治疗糖尿病的方法主要为传统的治疗方法有注射胰岛素、口服降糖药、控制饮食等，但往往最终患者造成胰岛素依赖，目前也还无合适的治疗手段。为了寻求更安全、有效及高质量的治疗方法，各国学者在不断地探索并寻找出更好的手术方法，提高糖尿病患者治疗效果或控制糖尿病患者胰岛素使用量。

肝干细胞是一种来源于肝脏Herring狭隙和肝内胆管的具有双向分化潜能的细胞，能够分化为肝实质细胞和胆管上皮细胞。由于肝脏和胰脏在胚胎发育时期，属于同一发育胚层，在发育过程中两者之间能相互转化分化。已有研究表明肝干细胞能在体内体外转分化成胰岛β细胞，在临床上具有治疗糖尿病的可能。杨立军，等，成体肝干细胞向胰腺产生内分泌激素的细胞的体外转分化，美国国家科学院报，2002，99(12)：8078-8083.

现有技术中肝干细胞多数来源于流产胎儿的肝脏。我们选用骨髓、脐血或脐带，通过体外分离纯化，以及传代培养，这就解决临床应用上来源的问题，和临床上不能应用异体细胞治疗的伦理上问题。现有技术仅公开了如何得到相关肝干细胞但并未教导对获取的肝干细胞进行处理。

发明内容

为了克服现有以无论西医还是传统中医，迄今为止在治疗糖尿病上均局限于“降糖”上，对于激活、修复、再生损伤、硬化、萎缩的胰岛β细胞均无良策。，本发明的目的是提供一种胰岛素基因修饰的肝干细胞及其制备方法、在制备糖 尿病制剂中的应用、以及制备该胰岛素基因修饰的肝干细胞的制剂。

本研究提供了一种以肝干细胞为目标，通过胰岛素基因修饰制备成能分泌胰岛素并分化为胰岛β细胞的肝干细胞，在治疗糖尿病应用克服现有治疗技术的不足和缺陷。其中，所述胰岛素基因修饰的肝干细胞通过以下方法制备，该方法包括：

对肝干细胞进行克隆好的胰岛素基因的腺病毒修饰的步骤，

所述胰岛素基因修饰的肝干细胞通过使肝干细胞与胰岛素基因克隆载体电穿孔完成，所述载体选自由病毒载体、脂质体、质粒和噬菌体所组成的组中。

本发明还提供了由上述的方法得到的胰岛素基因修饰的肝干细胞。

本发明还提供了一种胰岛素基因修饰的肝干细胞制剂，所述肝干细胞制剂包括肝干细胞，其特征在于，所述肝干细胞为本发明所述的胰岛素基因修饰的肝干细胞。

本发明还提供了本发明的胰岛素基因修饰的肝干细胞制剂在制备糖尿病制剂中的应用。

本发明还提供了一种制备本发明的胰岛素基因修饰的肝干细胞的制剂，其中，所述制剂包括：

1)肝干细胞基础培养基；

2)胰岛素基因；

3)胰岛素基因克隆的载体；

4)生理盐水；以及

5)使用说明书；

其中，所述胰岛素基因克隆的载体选自由腺病毒、慢病毒所组成的组中；

所述使用说明书包括本发明所述的肝干细胞的制备方法。

由于本发明的肝干细胞经过了胰岛素基因克隆的载体的修饰，由此得到的肝干细胞产生了与肝干细胞不同的变化(比如特异表达了胰岛素)，因此，由本发明提供的胰岛素基因修饰的肝干细胞以及由该胰岛素基因修饰的肝干细胞得到的制剂，能分泌胰岛素并在体内和体外分化为胰岛β细胞，从而为糖尿病的根治提供了可能。

附图说明

图1为实施例1的肝干细胞形态；

图2为实施例1的肝干细胞表达AFP和SK19的荧光免疫图片；

图3为实施例1的肝干细胞表达Nestin蛋白的荧光免疫图片；

图4显示胰岛素基因修饰的肝干细胞表达胰岛素蛋白电泳图片；

图5为胰岛素基因修饰的肝干细胞在糖尿病动物模型中修复受损部位的修复。治疗前后变化。

具体实施方式

本发明提供了一种胰岛素基因修饰的肝干细胞的制备方法，其中，该方法包括：

对肝干细胞进行克隆好的胰岛素基因的腺病毒修饰的步骤，

所述胰岛素基因修饰的肝干细胞通过使肝干细胞与胰岛素基因克隆载体电穿孔完成，所述载体选自由病毒载体、脂质体、质粒和噬菌体所组成的组中。