[发明专利]用环介导等温扩增方法检测诺沃克类病毒的试剂盒及方法

权利要求书

1.一种用环介导等温扩增方法检测诺沃克类病毒的试剂盒及方法，其特征在于该试剂盒包括：

环介导等温扩增反应液A：

    含有10X Thermopol反应缓冲液、300－500uM dNTP、2－4mM硫酸镁、0.8－1.2uM上游内引物、0.8－1.2uM下游内引物、0.2－0.3uM上游外引物、0.2－0.3uM下游外引物；

    其中10X Thermopol反应缓冲液含有200mM pH8.8的三羟基甲基氨基甲烷一盐酸、l00mM氯化钾、l00mM硫酸铵、20mM硫酸镁和1％曲拉通X－100；

其中，上游内引物为：

GAGATYGCGRTCYCCTGTCCATTTTGVTGGCAGGCCATGTTCCG；

AGATTGCGATCGCCCTCCCATTTTGCCCAGACAAGARSCMATGTT；

CCCAHGTGCTSARGTCTGAGAATTTTTGGATTTTTACGTGCCMAGRCA；

CCCAHGTGCTSARGTCTGAGAATTTTCATGAGTTTTATGTGCCAAAGT；

下游内引物为：

TAAATGATGATGGCGTCTAAGGATTTTRCCTCYGGTACYAGCTGGC；

TAAATGATGATGGCGTCTAAGGATTTTTAACCTCCGGYACSAGYTGA；

TGDGAATGAAGATGGCGTCGATTTTTTGRCCTCTGGKACGAGGTT；

TGTGAATGAAGATGGCGTCGATTTTYYTCTGGGACGAGRCMGGC；

TGTGAATGAAGATGGCGTCGATTTTGACCTCATTATTACTTTCTGGC；

TGTGAATGAAGATGGCGTCGATTTTTCWTTKTKRMYCTCTGGKACGA；

TGTGAATGAAGATGGCGTCGATTTTGYCTCAKTATTRCTYTCTGGC；

上游外引物为：

GGTTTRGARATGTATGTSCCA；

AAGGGGGSYTTGARATSTAC；

GAAGGTGGCATGGAYTTTTA；

AGTGGTGGTCTGGARTTTTA；

ACWGARYTSAARGARGGTGG；

GGCATGGTWATCAAAGAAG；

GAGATYAAGAGTGGTGGTC；

下游外引物为：

CATTGRWATWGGSTCAGCT；

TGCAAGAGGGTCAGAAG；

GWGGCAGTGGTTCAGCA；

TCHAGWGCCATBRYCTCRTT；

ACSGGYTCAAGAGCCATG；

AGCCCCMRCCACRGGYTC；

AGCGCCYGCAACKGGG。

2.根据权利要求2所述的用环介导等温扩增方法检测诺沃克类病毒的试剂盒，其特征在于环介导等温扩增反应液A每管23uL的组成为：

2.5uL l0X Thermopol反应缓冲液、1.0uL l0mMdNTP、1.0uL 20uM上游内引物、1.0uL 20uM下游内引物、0.25uL 20uM上游外引物、0.25uL 20uM下游外引物、0.5uL l00mM 硫酸镁、16.5uL ddH---₂0。

3. 根据权利要求1所述的用环介导等温扩增方法检测诺沃克类病毒的方法，其特征是依次包括（1）－（3）下列步骤：---

(1)病毒RNA的提取：-

A. 取250uL样本，加入1.5mL离心管中；

B. 加入500uL的Solution A，剧烈振荡混匀后，室温放置5分钟；

C. 加入125uL的Solution B和125uL的DB Buffer，均匀混合后，12,000 rpm离心5分钟；

D. 将试剂盒中的Spin Column安置于Collection Tube（2mL）上；

E. 将上述操作步骤3的上清液850uL转移至Spin Column中，12,000 rpm离心2分钟，弃滤液；

F. 将500 uL的Rinse A加入至Spin Column中，12,000 rpm离心1分钟，弃滤液；

G. 将500 uL的Rinse B加入至Spin Column中，12,000 rpm离心1分钟，弃滤液；

H. 重复操作步骤7；

I. 将Spin Column安置于新的1.5 ml的离心管上，在Spin Column膜的中央处加入30 uL Elution Buffer（含RNase Inhibitor 1uL），室温静置1分钟；

J. 12,000rpm离心1分钟洗脱病毒RNA；

(2) RT反应：

A．按下述成分配置好20 uL的反应液：4uL 氯化镁、2uL 10×RT 缓冲液、6.5uL Rnase free dH₂O、2uL dNTP Mixture (各10mM)、0.5uL Rnase Inhibitor (40U/μl)、2uL AMV Reverse Transcriptase(5U/μl)、1uL Random 9mers (50pmol/μl)、2uL样品RNA；

B．30℃ 保温 10分钟；

C．42℃ 左右 45分钟；

D．99℃ 加热 5分钟；

E．5℃  保持5分钟 获得DNA模板；

(3) 诺沃克类病毒的环介导等温扩增：

A．在装有23uL环介导等温扩增反应液A的反应管中加入luL待检模板DNA，于恒温金属浴上95℃放置3－5分钟，立即置于冰上1－3分钟；

B．在反应管中加入luL DNA聚合酶B；

C．于恒温金属浴上60－65℃放置45－90分钟；

D．将金属浴调到80－95℃终止反应，3－5分钟后取出待检；

(4)显色检测：

在反应管中加入1uL显色剂C，直接用肉眼观察颜色变化，反应液颜色变为绿色，说明待检样品含有或为诺沃克类病毒。