[发明专利]一种提取分离杆菌肽的方法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种从杆菌肽发酵中分离提取杆菌肽的方法，具体地说，涉及一种从5～20W/V％的杆菌肽发酵液中分离提取杆菌肽的方法。

背景技术：

杆菌肽(Bacitracin，CAS1405-87-4)是一种白色或浅黄灰色粉末，无臭、味苦。在水、甲醇、丙酮、氯仿中几乎不溶，而易溶于吡啶中，在乙醚中微溶。该物质由多种氨基酸结合而成的不稳定的多肽，含有A、A₁、B、C等至少9种组分组成的混合物，其中杆菌肽A为主要活性组分。1943年被美国的B.H.Johnson第一次发现，可以从枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)和B类地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)发酵液中提取分离制得，广泛用于治疗深部真菌、皮肤和粘膜真菌等疾病。

杆菌肽主要通过发酵法制备，从发酵液提取分离杆菌肽的方法很多，主要有离子交换法、有机溶剂萃取法等方法，美国专利US2776240和US2915432公开了用离子交换吸附法提取分离杆菌肽的方法，这些方法的不足之处是收率低、工艺复杂。美国专利US2498165和US2609324公开了用有机溶剂萃取提取分离杆菌肽的方法，这些方法使用的有机溶剂通常为醇类或各种酯类，工艺较为简单，但由于大量使用有机溶剂，对溶剂的选择性和再生能力提出了较高要求，而且这种有毒、易爆、易挥发溶剂的使用，对环境造成了严重污染，给操作也带来不便。同时有机溶剂价格昂贵，其易挥发的特性也使得工业运行的成本大幅度提高。

因此，杆菌肽的提取分离方法已经不少，但是，这些方法运用在工业生产中，都存在不少困难。

发明内容：

本发明的目的是提供一种提取分离杆菌肽的方法，该方法具有效率高、设备简单、经济性好、分离系数大、选择性高、能耗低、无二次污染、可在常温下连续操作等特点。

本发明是通过如下步骤实现的：

1)、超滤提取分离杆菌肽浓缩液：杆菌肽发酵液经过经过酸化，如盐酸、硫酸、草酸，震动筛过滤或离心去除菌体后，超滤去除菌体和大分子杂质、树脂吸附脱除无机盐、真空蒸发浓缩得到杆菌肽浓缩液；

2)、杆菌肽浓缩液制备杆菌肽结晶体：杆菌肽浓缩液经过溶剂萃取、脱色、纳滤、结晶分离、干燥、粉碎、筛分、检验、成品包装等生产步骤得到合格的杆菌肽。

具体步骤如下：

(1)将杆菌肽发酵液经过酸化，如盐酸、硫酸、草酸，震动筛过滤或抽滤或泵入离心机中分离，将分离后的清液输入贮罐中。

(2)将经过分离菌体后的杆菌肽发酵液清液再经超滤过滤除去残余菌丝体、蛋白质、糖、色素等生物大分子，并用1～5倍的水洗涤菌渣中残留的杆菌肽，边清洗，边超滤以获得高的产品收率。超滤所用的膜组件为无机膜组件，主要由1根、3根、7根、19根、37根多通道、管式、平板式、蜂窝体等膜元件组成，膜材料为截留分子量5000～200000的陶瓷膜、沸石膜、玻璃膜。

(3)杆菌肽发酵液也可以直接经过超滤过滤除去残余菌丝体、蛋白质、糖、色素等生物大分子，并用1～5倍的水洗涤菌渣中残留的杆菌肽，边清洗，边超滤以获得高的产品收率。超滤所用的膜组件为无机膜组件，主要由1根、3根、7根、19根、37根多通道、管式、平板式、蜂窝体等膜元件组成，膜材料为截留分子量5000～200000的陶瓷膜、沸石膜、玻璃膜。

(4)将经超滤去杂质所得的杆菌肽发酵液的超滤透析液和残余菌液洗涤水超滤透析液合并，用阳离子交换树脂静态吸附，如Amberlite IRC-50、Duolite C-20，树脂洗脱剂选用亲水性的低级醇类，如甲醇、乙醇；洗脱剂浓度为5％～45％，收集高含量部分洗脱液。

(5)将杆菌肽洗脱液加入真空旋转蒸发器中，在10～40Kpa、30～60℃条件下减压蒸发去除洗脱剂及部分水，得到效价大于3000u/ml杆菌肽浓缩液。

(6)向杆菌肽浓缩液中加入1～4倍的萃取剂，如甲酸乙酯、乙酸乙酯、正丁醇，分离去除水相，再经过真空旋转蒸发器脱除萃取剂，向有机相中加入1～3W/V％的活性炭脱色，调节pH至3.5～6.5，搅拌，过滤，得到杆菌肽脱色液。

(7)将杆菌肽脱色液用纳虑浓缩脱盐，浓缩至效价大于5000u/ml，电导小于2000μs/cm。除菌过滤，喷雾干燥，得到效价大于65U/mg的杆菌肽。纳滤所用的膜组件为板式膜组件、管式膜组件和卷式膜组件，纳滤膜材料为截留分子量200～500的醋酸纤维膜、聚醚砜膜、聚酰胺膜。

与已有的方法比较，本发明所采用的技术具有如下优点：