[发明专利]定量检测食品和中药中速灭威含量试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明属于免疫学分析技术领域的一种定量检测农药速灭威含量的试剂盒及其检测方法，涉及到有机化学合成、免疫化学、生物化学等技术，适用于食品和中药中速灭威残留的快速检测。

背景技术

速灭威(Metolcarb)是一种氨基甲酸酯类杀虫剂，主要起触杀和熏杀作用，抑制了虫体胆碱酯酶活性，使之乙酰胆碱堆积中毒而死亡，为中等毒性的杀虫剂，无慢性毒性，无致癌、致畸、致突变作用，对鱼有毒，对蜜蜂高毒。纯品对雄性小白鼠口服毒性LD₅₀为268mg/kg，大鼠口服毒性LD₅₀为498-500mg/ml，大鼠经皮LD₅₀为6000mg/kg。主要用于防治棉花、水稻、茶树、柑橘等作物的作物的害虫，具有杀虫广谱、残效长、杀死率高的特点。但是由于国家禁用一些高毒性如甲胺磷等农药，因而导致了速灭威的用量大大增加，已对食品、蔬菜、水源和环境造成了污染，对人类的健康存在着潜在的威胁。速灭威的大量使用和残留期较长等特点使得速灭威残留量的检测监控十分迫切。传统的检测速灭威残留的方法是分光光度法、高效液相色谱法、气相色谱/质谱等仪器分析方法。仪器检测虽然可靠有效，但是仪器昂贵，对技术人员要求高，并且需要烦琐的前处理技术，从而造成分析时间加长，同时检测样品量有限。

小分子化合物免疫分析技术为复杂样本中痕量农药残留的快速分析开辟了新的道路，已成为现今国际上农药残留分析很活跃的研究领域之一，尤其酶联免疫分析(ELISA)应用方面取得较大进展。酶联免疫法克服了仪器检测的缺点，方法简便快捷、特异性强、灵敏度高，样品容量大，分析成本低廉。

酶联免疫法(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)是将农药小分子作为半抗原，通过一定途径与生物大分子(如蛋白质等)载体以共价键相偶联制备人工抗原，用制备的人工抗原免疫动物，连接在载体上的农药分子便成为抗原决定簇，被免疫动物产生对该农药分子具有特异性的抗体，在此抗体上连接上标记物(酶、荧光物质、放射性同位素等)，利用抗原抗体特异性反应和抗体上标记物的放大作用，对样本中微量农药残留物进行定性、定量检测。

发明内容

本发明的目的就是要克服现有技术的不足，提供一个可以定量检测食品以及中药中的速灭威含量的试剂盒及检测方法。该检测方法的灵敏度可达μg/kg级别。

本发明是通过以下技术方案来实现的：

一种采用直接ELISA法技术定量检测食品及中药中速灭威含量的试剂盒，其特征在于：该试剂盒由试剂组和96孔包被板构成。

所述的试剂组包括：

(1)浓缩PBS缓冲液：40mM磷酸盐缓冲液，pH 7.4，使用时用双蒸水5倍稀释；

(2)底物A：含过氧化氢脲的乙酸钠缓冲溶液；

(3)底物B：3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)的二甲基亚砜溶液；

(4)浓缩洗涤液：含1％吐温-20的磷酸盐缓冲溶液，使用时用双蒸水5倍稀释；

(5)终止液：1.25M的硫酸；

(6)速灭威标准溶液：其速灭威标准溶液母液为1mg/mL，使用时用PBS缓冲溶液稀释到2000μg/L后，再按1∶5稀释6个梯度；

(7)酶标记的速灭威抗原溶液：速灭威半抗原与辣根过氧化物酶(HRP)的偶联物，使用时用PBS缓冲液稀释1万倍。

上述的包被板为96孔或48孔酶标板，是由多克隆速灭威抗体包被于酶标板上。抗体是用pH为9.6的Na₂CO₃-NaHCO₃包被缓冲溶液稀释到1μg/100μL，然后以每孔100μL包被于酶标板中，4℃过夜或者37℃恒温温育3小时，弃去包被溶液后用洗涤液洗板三次，加入200μL冻干液封闭1小时，洗涤液洗板四次后冻干真空包装，于4℃保存。冻干液为含质量浓度为1％BSA的Tris-HCl缓冲溶液。

使用上述试剂盒进行样品检测包括以下几个步骤：

(1)室温下样品的前处理，包括中药的前处理；

(2)检测前，将试剂盒打开，所有试剂和标本都必须在室温下平衡1-2小时；

(3)酶标抗原用PBS缓冲溶液稀释1万倍，在包被板上对速灭威标准溶液及待测样品进行双孔平行加样(各50μL/孔)，同时加入稀释后的酶标抗原(50μL/孔)，空白加100μL PBS，摇床上混匀1分钟，37℃温育1小时；