[发明专利]吴茱萸及其提取物的高压液相指纹图谱的建立方法

权利要求书

1.一种贵州余庆GAP基地吴茱萸高效液相色谱指纹图谱的建立方法，其特征在于包括以下步骤：

步骤一，供试品溶液的制备：

精密称取干燥至恒重的样品粉末0.1g～1g，过60目筛，置于具塞锥形瓶中，加入体积比为45％～90％的甲醇溶液25mL～50mL，称重，超声处理10分钟～90分钟，放冷，称重，补足减失的重量，滤过，取续滤液适量，以0.45μm微孔滤膜滤过，即得；

步骤二，高效液相色谱分析：

精密吸取步骤一的供试品溶液2μL～20μL进样，色谱条件如下：色谱柱为Diamonsil C₁₈柱，填料粒径2μm～8μm，柱长150mm～250mm，柱温：20℃～35℃；流速：0.8mL·min^-1～1.2mL·min^-1；色谱峰光谱采集范围：190nm～400nm，流动相按体积比由甲醇-0.01～0.02％磷酸水溶液(pH 2.95～3.05)混合而成，采用线性梯度洗脱方式：从0分钟→35分钟→40分钟→53分钟→56分钟→80分钟，甲醇比例：15％→31％→50％→53％→72％→95％(体积比)，0.02％磷酸水溶液比例：85％→69％→50％→47％→28％→5％(体积比)，检测波长250nm±2nm；得到吴茱萸HPLC指纹图谱；

步骤三，分析比较：

测定12批吴茱萸药材样品高效液相色谱指纹图谱并进行分析比较，得到由其共有特征峰构成的吴茱萸药材指纹图谱，该指纹图谱具有的22个共有峰的保留时间t_R分别为：10.0分钟、12.5分钟、14.0分钟、16.5分钟、17.4分钟、18.7分钟、23.0分钟、24.6分钟、26.1分钟、28.2分钟、30.1分钟、36.3分钟、47.7分钟、50.0分钟、51.9分钟、52.6分钟、62.3分钟、65.4分钟、69.4分钟、79.5分钟、81.1分钟、82.6分钟。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征是：保留时间t_R＝26.1分钟的第9号峰为绿原酸，t_R＝65.4分钟的第18号峰为吴茱萸碱，t_R＝69.4分钟的第19号峰为吴茱萸次碱。

3.一种贵州余庆吴茱萸提取物高效液相色谱指纹图谱的建立方法：

步骤一，吴茱萸提取物的制备：

吴茱萸水提取物的制备：称取适量吴茱萸，用5～15倍量水回流提取1～3次，每次0.5小时～3小时，合并滤液，置于蒸发皿中，水浴蒸至相对密度为1.20～1.35的稠膏，然后后将稠膏置减压干燥箱内于0.02Mpa～0.15Mpa，40℃～60℃下干燥24小时～48小时，取出研碎即得；

吴茱萸醇提取物的制备：称取适量吴茱萸，用5～15倍量60％～80％(体积比)的乙醇回流提取1～3次，每次2～4小时，合并滤液，置于蒸发皿中，水浴蒸至相对密度为1.20～1.35的稠膏，后将稠膏置减压干燥箱内于0.02Mpa～0.15Mpa，40℃～60℃下干燥24h～48h，取出研碎即得；

步骤二，供试品溶液的制备：

供试品溶液的制备：称取0.1g～1g干燥的粉浸膏，精密称定，置于50mL的具塞锥形瓶中，加入45％～90％甲醇(体积比)25ml～50mL，称重，超声提取10分钟～90分钟，放冷，称重，补足减失的重量，滤过，去续滤液适量，以0.45μm微孔滤膜滤过，即得；

步骤三，高效液相色谱分析：

高效液相色谱分析：精密吸取供试品溶液2μL～20μL进样，色谱条件如下：色谱柱ZORBAX Eclipse XDB-C₁₈分析柱，填料粒径5μm，柱长150mm，柱内径4.6mm，柱温20℃～35℃，流动相为乙腈-0.1％(体积比)甲酸水溶液(pH 2.55～2.65)混合而成，采用流动相二元梯度洗脱系统：0分钟→5分钟→38分钟→65分钟，乙腈：5％→5％→23％→100％，0.1％甲酸(体积比)水溶液95％→95％→77％→0％，流速为1mL·min^-1，检测波长为258nm±2nm；得到吴茱萸提取物HPLC指纹图谱；

步骤四，分析比较：

测定吴茱萸提取物样品高效液相色谱指纹图谱并进行分析，得到由其特征峰构成的吴茱萸提取物指纹图谱，该指纹图谱具有的20个特征峰的保留时间tR分别为：

吴茱萸醇提取物的保留时间：9.6分钟、12.2分钟、13.2分钟、15.9分钟、16.4分钟、20.8分钟、21.3分钟、22.9分钟、24.4分钟、25.7分钟、28.3分钟、35.7分钟、39.2分钟、40.3分钟、41.3分钟、53.3分钟、54.0分钟、55.6分钟、56.6分钟、66.1分钟。

吴茱萸水提取物的保留时间：9.6分钟、12.1分钟、13.2分钟、15.9分钟、16.4分钟、20.8分钟、21.3分钟、22.9分钟、24.4分钟、25.6分钟、28.2分钟、35.7分钟、39.1分钟、40.2分钟、41.6分钟、53.3分钟、54.0分钟、55.5分钟、56.6分钟、63.8分钟。