[发明专利]一种检测梅毒血清抗体的rTpN15-17-47-ELISA的制备方法

权利要求书

1.一种检测梅毒血清抗体的rTpN15-17-47-ELISA的制备方法，依次包括以下步骤：采用基因工程技术构建tpN15、tpN17和tpN47的人工融合基因tpN15-17-47及其原核表达系统E.coliBL21DE3^{pET42a-tpN15-17-47}，提纯重组表达产物rTpN15-17-47为包被抗原，建立用于检测梅毒血清抗体的rTpN15-17-47-ELISA。

2.根据权利要求1所述的一种检测梅毒血清抗体的rTpN15-17-47-ELISA的制备方法，其特征在于所述的人工融合基因tpN15-17-47具有序列表5所示的核苷酸序列和氨基酸序列。

3.根据权利要求2所述的一种检测梅毒血清抗体的rTpN15-17-47-ELISA的制备方法，具体包含以下步骤：

1)梅毒螺旋体tpN15、tpN17和tpN47基因的克隆和测序；

2)人工融合基因tpN15-17-47及其原核表达系统构建和测序；

3)含IPTG的LB培养基中诱导重组蛋白抗原分子rTpN15-17-47表达，SDS-PAGE和BioRad凝胶图象分析系统确定重组表达产物rTpN15-17-47的表达情况和产量；

4)Ni-NTA亲和层析法提纯重组表达产物rTpN15-17-47；

5)rTpN15-17-47作为包被抗原的ELISA的建立。

4.根据权利要求3所述的一种检测梅毒血清抗体的rTpN15-17-47-ELISA的制备方法，其特征在于所述梅毒螺旋体tpN15、tpN17和tpN47基因的克隆方法分别是：

1)取离心沉淀的梅毒病人硬性下疳分泌物，用苯酚-氯仿提取、乙酸钠和无水乙醇沉淀获得基因组DNA；2)以梅毒螺旋体基因组DNA为模板，采用PCR分别扩增tpN15、tpN17和tpN47基因，各上下游引物序列中均分别设置限制性核酸内切酶位点NdeI和XhoI；3)PCR产物经电泳后，在紫外线下观察目的DNA扩增条带；4)采用PCR产物纯化试剂盒，先提取目的DNA扩增条带；然后采用T-A克隆试剂盒，用T4DNA连接酶将提纯的DNA条带与克隆质粒如pUC-M-T连接；5)取用大肠杆菌DH5α株，将其接种、培养，然后收集细菌沉淀，制备成感受态E.coli DH5α悬液；6)在上述感受态E.coli DH5α悬液中加入上述连接产物，加入SOC培养液培养；7)在LB琼脂平板上涂布接种上述SOC培养物；8)选取SOC培养物上的白色菌落在含LB培养液中培养，采用细菌质粒提取试剂盒进行质粒提取，提取的质粒进行NdeI和XhoI酶切、电泳分离，在紫外线下分别确认有目的DNA片段tpN15、tpN17和tpN47后，测定克隆片段的核苷酸序列，序列正确者即为重组质粒pUC-M-T^tpN15、pUC-M-T^tpN17或pUC-M-T^tpN47。