[发明专利]一种胃液中piRNA的检测方法无效
| 申请号： | 201010605793.1 | 申请日： | 2010-12-27 |
| 公开（公告）号： | CN102127600A | 公开（公告）日： | 2011-07-20 |
| 发明（设计）人： | 郭俊明;崔龙;肖丙秀;宋皓军 | 申请（专利权）人： | 宁波大学 |
| 主分类号： | C12Q1/68 | 分类号： | C12Q1/68 |
| 代理公司： | 宁波奥圣专利代理事务所(普通合伙) 33226 | 代理人： | 程晓明 |
| 地址： | 315211 浙*** | 国省代码： | 浙江;33 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 胃液 pirna 检测 方法 | ||
1.一种胃液中piRNA的检测方法，其特征在于包括下述步骤：
a、胃液抽取和中和：用胃管抽取空腹胃液5ml，放入离心管中，置于冰上，然后加入质量百分浓度为20%的氢氧化钠溶液0.5ml，置摇床中常温振摇20分钟，用质量百分浓度为20%的氢氧化钠溶液调整pH值至7.0±0.5，再加入质量百分浓度为1%的胰蛋白酶溶液20μl，漩涡混匀，置37℃水浴箱中消化15分钟，4℃下，1000rpm离心20分钟；
b、RNA释放：取步骤a的上清液200μl置于消毒离心管中，加入50μl灭菌的焦碳酸乙二酯处理过的双蒸水，混匀，再加入Trizol溶液1ml，反复吹打20次，室温下静置10分钟， 4℃下，12000rpm离心15分钟；
c、氯仿提取：将步骤b的上清液移入另一消毒离心管中，加入0.2ml氯仿，漩涡振荡15秒，室温下静置5分钟，4℃下，12000rpm离心15分钟，吸取上层水相移入焦碳酸乙二酯处理过的灭菌离心管中；
d、异丙醇沉淀：在步骤c的灭菌离心管中加入与所述上层水相等体积的异丙醇，混匀，室温下静置20分钟，4℃下，12000rpm离心15分钟，弃上清得沉淀；
e、乙醇洗涤：在步骤d的沉淀中，加入质量百分浓度为75%的乙醇1ml，颠倒混匀20次洗涤，4℃下，12000rpm离心3分钟，弃上清，再用乙醇同样重复洗涤一次，4℃下，12000rpm离心3分钟，弃上清，室温下干燥10分钟，加15μl双蒸水溶解，得到RNA提取液，-80℃保存备用；
f、RNA逆转录：用miScript 逆转录试剂盒对步骤e的RNA提取液进行逆转录反应，得到cDNA溶液，置-20℃保存备用，具体操作依该试剂盒说明书进行；
g、PCR检测：用miScript SYBR Green PCR检测试剂盒对步骤f的cDNA溶液进行PCR扩增反应，扩增的上游引物为piRNA特异性扩增上游引物或小RNA U6特异性扩增上游引物，扩增的下游引物为小RNA通用下游引物，再用荧光定量PCR仪检测，具体操作依检测试剂盒和荧光定量PCR仪说明书进行。
2.如权利要求1所述的一种胃液中piRNA的检测方法，其特征在于所述piRNA特异性扩增上游引物为has-piR-651扩增上游引物。
3.如权利要求1所述的一种胃液中piRNA的检测方法，其特征在于所述piRNA特异性扩增上游引物为has-piR-823扩增上游引物。
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