[发明专利]人脐带间充质干细胞及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及原始间充质干细胞的制备方法，尤其涉及以人脐带沃顿胶为材料制备人脐带间充质干细胞及其制备方法。

技术背景

间充质干细胞(Mesenchymal stem cell，MSC)是一类具有多向分化潜能的组织干细胞，可从胎儿血液、肝脏、骨髓、脂肪等多种组织获得。骨髓源性MSC存在高度病毒污染的可能，且随着年龄增长其细胞数量和扩增、分化能力出现明显下降趋势。其他方法如从脐血和外周血中培养MSC具有一定难度，且MSC在足月分娩的脐血或动员的外周血中数量尚存在争议。进来有学者从娩后的废弃材料脐带中分离培养MSC，并进行形态学、分化功能和表面标志物等生物学表型鉴定。脐带是连于胚胎脐部与胎盘问的索状结构，外被羊膜、内含分化的粘液性结缔组织，结缔组织内除闭锁的卵黄囊和尿囊外，还有脐动脉和脐静脉。脐带中的MSC来源分为四种：①来源于沃顿胶(Wharton’s jelly，WJ)，它是包裹血管周围的粘蛋白样组织，距血管外周大约3mm，富含透明质酸和葡萄糖胺聚糖，形成了成纤维细胞周围的水凝胶结构；②来源于脐血管周围；③来源于脐血；④来源于脐静脉血管内皮下。McElreavey等从人脐带的WJ组织中发现一种具有高分化潜能的成纤维样细胞。Sarugaser等发现WJ区域富含祖细胞，这个区域的细胞被称为人脐带血管外周细胞(human umbilical cord perivascular cell，HUCPV)。HUCPV细胞具有较高的成纤维样细胞集落形成能力，且骨诱导后可增殖分化形成骨结节。Romanov等采用培养骨髓MSCs的方法进行培养，从人脐静脉内皮和内皮下层分离到类似骨MSCs的细胞。上述研究显示，脐带组织含有丰富的MSCs，能够成为MSCs的良好来源。

目前分离和培养人脐带MSC的方法不尽相同，分离效果也大相径庭。分离方法大体上包括胶原酶消化法、植块法或两者的结合、脐静脉内膜消化法，其中胶原酶消化法多以胶原酶II为主。

人脐带MSC在适当的诱导条件下能向多种组织细胞分化，是理想的组织工程种子细胞。MSC诱导植入有望成为较广泛的细胞治疗于段。研究表明MSC能够植入肌肉退化组织并向肌细胞分化，也能够促进造血干细胞的植入；MSC还可应用于软骨组织重建等生物工程；也可能成为未来抗癌治疗中携带自杀基因或抗癌腺病毒药物的载体细胞。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，提供一种材料来源易得，细胞倍增时间短的人脐带间充质干细胞及其制备方法，按本发明方法制备的间充质干细胞具有更强的自我更新及多向分化潜能，而且易于冷冻保存。

实现本发明目的的技术方案，采用胎儿脐带为原材料制备间充质干细胞。制备方法为：脐带从保存液取出后，剪断双侧结扎部分，去除脐带血管内淤血，将脐带浸入含抗生素的Hanks’Balanced Salt Solution(HBSS)(1×)中，用D-PBS反复冲洗脐带和脐静脉内腔3次，剔除血管，暴露沃顿胶，然后将脐带剪成1-3mm³大小的组织块后放入试剂瓶，加入0.1％的消化液，置于37℃恒温震荡仪内持续消化4-10h，100目筛网过滤，离心收集细胞。加入HBSS液冲洗细胞3次，用DMEM/F12培养基溶液重悬细胞，调整细胞密度4.8×10³～1×10⁴/cm²，接种于6孔板内，37℃、体积分数为5％CO₂孵箱内培养，24h后换液，以后每隔3天换液一次，待细胞达到80％融合时，传代培养，即时使用或冷冻保存备用。

作为优化，制备的间充质干细胞为脐带沃顿胶、脐带血管周围、脐血和脐静脉血管内皮下的任何一种来源或全部。

用于清洗脐带及其血管残留血液的溶液是不含钙镁离子的D-PBS溶液；冲洗沃顿胶组织块所用液体优选无血清DMEM/F12培养基溶液。

作为优化，脐带是经过D PBS清洗血管后剪成1-3mm³的组织块，进入下一分离程序。

用于原始间充质干细胞的制备方法，可用II型胶原酶消化法、IV型胶原酶消化法、II型胶原酶和胰酶联合消化法或II型胶原酶和透明质酸酶混合液消化脐带组织，作为优化，首选II型胶原酶和透明质酸酶混合液进行消化。

作为优化，用于消化脐带组织块的消化液为II型胶原酶和透明质酸酶的混合溶液，其质量体积百分比浓度为0.1％。

作为优化，接种细胞使用的培养液为含有体积分数为10-20％的FBS和25mmol/L谷氨酰胺的DMEM/F12。