[发明专利]高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗（JXA1-R株）实时荧光RT-PCR检测方法和试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)的实时荧光RT-PCR检测方法。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)引起的一种以怀孕母猪繁殖障碍、尤其哺乳仔猪呼吸困难为特征的高度接触性传染病。本病在1987年首次暴发于美国，随后在加拿大、欧洲与亚洲相继出现，目前已经在世界范围内流行，每年造成巨大的经济损失。我国在1995年首次出现PRRS，随后迅速蔓延。2006年我国暴发了由猪繁殖与呼吸综合征高致病性变异毒株(highly pathogenic PRRSV，HP-PRRSV)引起的以体温高、发病率高、死亡率高为主要临床特征的高致病性猪繁殖与呼吸综合征(highly pathogenicPRRS，HP-PRRS)，给我国养猪业造成了极其严重的打击。HP-PRRS被世界动物卫生组织(OIE)列为必须报告的法定传染病之一，是我国《一、二、三类动物疫病病种名录》中的一类动物疫病。目前防控本病的主要措施是疫苗免疫接种。而今高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)已在国内得到广泛应用，它以其良好的免疫保护效力和安全性对高致病性猪繁殖与呼吸综合征的防控起到了重要作用。

传统的PRRSV检测方法主要包括病毒的分离与鉴定、免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)、间接免疫荧光试验(IFA)、间接酶联免疫吸附试验(间接ELISA)和反转录-聚合酶链反应试验(RT-PCR)等，它们在病毒诊断与进出口检验检疫中发挥了重要作用，但各自在敏感性、特异性或时效性等方面存在不足，且难以将疫苗株(JXA1-R)与野毒株区分从而达到检测疫苗株(JXA1-R)的目的。目前，高致病性PRRSV变异株的实时荧光定量RT-PCR等检测方法虽然已经建立，但是仍然无法特异性针对疫苗株(JXA1-R)进行检测。因此，建立一种快速简便、特异性强、敏感性高、可靠性好的高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)的检测方法意义重大。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术不足，提供一种高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)的实时荧光RT-PCR检测方法。此方法快速简便、特异性强、敏感性高、可靠性好，为评价高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)免疫效果及疫苗生产的质量监控提供强有力的技术支持。

本发明是通过以下技术方案实现的：

中国动物疫病预防控制中心兽医诊断室(农业部兽医诊断中心)提供活疫苗及如下病毒：高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)(制备用毒株由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保存，CGMCC No.2467)；高致病性猪繁殖与呼吸综合征2006-2010年不同时期野毒株；美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒经典毒株、欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒，及各自活疫苗；其他猪源病毒包括马动脉炎病毒(EAV)、猪瘟病毒(CSFV)、日本乙型脑炎病毒(JEV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)、猪圆环病毒2型(PCV2)。

高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)特异性引物和探针设计：所述的特异性引物，指的是：长度为20个碱基左右的寡核苷酸链，与高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)Nsp2基因高度保守区的特异性核苷酸片段完全相同或者反向互补；所述的特异性探针，指的是：长度为13到21个碱基之间的寡核苷酸链，其5’端标记FAM或HEX等荧光激发基团，3’端标记自身不发光的淬灭基团，同时另增加一个小沟结合物(minor groovebinder，MGB)分子，与高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)Nsp2基因高度保守区的特异性核苷酸片段完全相同或反向互补。

本文所列出的核苷酸序列，均由5’端向3’端方向书写。

用于检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)的寡核苷酸引物对特征如下：由序列为TCCACGCATCCTCGGG的上游引物LV-HP-PRRSV-F3和序列为TGCTCTCGTCAGACTCCCGT的下游引物LV-HP-PRRSV-R2组成；