[发明专利]检测炭疽杆菌、鼠疫耶尔森菌及嗜肺军团菌多重实时荧光PCR的引物、探针序列及方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测病原微生物的PCR引物、探针序列及方法，尤其是一种同时检测炭疽杆菌、鼠疫耶尔森菌及嗜肺军团菌多重实时荧光PCR的引物、探针序列及方法，属于生物技术领域。

背景技术

炭疽杆菌能引起羊、牛、马等动物及人类的炭疽病，严重威胁公众财产、健康和生命安全。鼠疫耶尔森菌可引起烈性传染病鼠疫，疾病传播快，病死率高(70％-100％)，历史上发生过多次毁灭性的流行，也是经典的致死性细菌。嗜肺军团菌可由气溶胶介导引起军团菌病，流行致死率可高达30％以上，我国自1982年在南京首次证实军团菌病例以来，全国已有多起散发与暴发流行的报道。炭疽杆菌、鼠疫耶尔森菌、嗜肺军团菌均可通过空气飞沫传播，可形成气溶胶，易引发突发公共卫生事件。快速有效的病原检测技术在炭疽、鼠疫、军团菌病疫情的预防、控制及应急反应决策中起着极其关键的作用，对保障公众的生命财产安全具有重要意义。

目前对炭疽杆菌、鼠疫耶尔森菌、嗜肺军团菌的检测方法，主要基于对病原体的培养、毒素检测、染色镜检、血清学(抗原或抗体)检测等，但这些方法均不适合早期快速侦检，难以适应疫情控制的需要。虽然近年来也发展了常规PCR及DNA探针杂交技术、胶体金技术、基因芯片技术等，但常规PCR及DNA探针杂交技术存在特异性和敏感性的问题；胶体金技术敏感性较差，假阳性和假阴性偏高；基因芯片技术的检测成本及硬件要求均较高，并且重复性较差(一般一个样品需重复3次才能做出综合评价)，难于推广，目前仅适合学术性科研。此外，这些检测方法均属开放式方法，检测烈性传染病病原体时均存在严重的生物安全与传播隐患，而且对实验仪器和环境造成交叉污染的危险性较大，易导致假阳性结果等。目前文献所报道的这些方法，除基因芯片外均为单重检测方法，所需设备、试剂、反应参数迥异，难于整合，不能同时检测和预警上述三种病原体，耗时较长。

实时荧光定量PCR是一种封闭快速检测技术，由光电倍增管(PMT)扫描扩增产物，经计算机数据处理后得出结果，反应在全封闭的条件下进行，扩增过程中可避免由于以前基因扩增产物如PCR产物气溶胶等的污染而可能引起的假阳性结果，还可避免病原体核酸片断对人体产生的潜在危害，无须开盖PCR后处理，具有实时、直观、准确的特点，尤其在烈性传染病病原体的检测上，有着明显的优势，有示范推广价值。实时荧光PCR技术检测病毒或细菌，其灵敏度比常规PCR高出10～100倍以上，整个检测时间缩短至3～4小时内，探针的应用使假阳性达到了最小化。

多重实时荧光PCR是在同一反应体系中加入多组引物对和多个探针，同时检测多个目的基因的方法。该方法在具有实时荧光定量PCR快速、敏感的特性同时，可以实现一管多检，达到省时省力的目的，提高了检测速度和效率，尤其适合疫情早期预警、排除所必须的同时筛查检测的需要。

目前，还没有一种能同时检测炭疽杆菌、鼠疫耶尔森菌及嗜肺军团菌的多重实时荧光PCR的引物、探针序列及方法，而这种引物、探针序列及方法对于应对突发传染病疫情和流行病学调查、突发公共卫生事件应急处置的早期检测等具有重要的意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：克服现有技术存在的问题，提供一种检测炭疽杆菌、鼠疫耶尔森菌及嗜肺军团菌多重实时荧光PCR的引物、探针序列及方法。

本发明解决其技术问题的技术方案如下：

本发明提供一种检测炭疽杆菌、鼠疫耶尔森菌及嗜肺军团菌多重实时荧光PCR的引物、探针序列，其特征是，包括由capa引物对和capa探针、及pa引物对和pa探针构成的炭疽杆菌引物探针序列集；

所述capa引物对包括两组序列：

(1)capa-F：SEQ ID No：1和capa-R：SEQ ID No：2；

(2)capa-Fc：SEQ ID No：19和capa-Rc：SEQ ID No：20；

所述capa探针包括两个序列：

(3)capa-probe：SEQ ID No：3；

(4)capa-probec：SEQ ID No：21；

所述pa引物对包括两组序列：

(5)pa-F：SEQ ID No：4和pa-R：SEQ ID No：5；

(6)pa-Fc：SEQ ID No：22和pa-Rc：SEQ ID No：23；

所述pa探针包括两个序列：

(7)pa-probe：SEQ ID No：6；

(8)pa-probec：SEQ ID No：24。