[发明专利]T细胞免疫原基因TI及其在口蹄疫蛋白亚单位疫苗和灭活疫苗中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及兽医药领域，尤其是一种T细胞免疫原基因TI及其在口蹄疫蛋白亚单位疫苗和灭活疫苗中应用。

背景技术

口蹄疫(Foot-and-Mouth Disease，FMD)是由口蹄疫病毒(FMDV)引起的一种急性、热性、高度接触传染性的动物疫病。主要侵染猪、牛、羊等偶蹄动物，被国际兽疫局列为必须通报的烈性传染病。该病传播途径多、传播速度快，曾多次在世界范围发生大流行。

FMDV是小RNA病毒科(Picornaviridae)，口蹄疫病毒属(Aphthovirus)的成员该病毒有七个血清型，分别为O、A、C、Asia 1、SAT1、SAT2、SAT3，每个血清型又可产生很多基因亚型，血清型之间无交叉保护反应。FMDV的核酸为单股正链的RNA分子，基因组全长约8500个碱基，只含有一个大的开放阅读框，表达产生的聚蛋白逐级裂解产生病毒的结构蛋白(VP1、VP2、VP3、VP4)和非结构蛋白(Lab，2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D)，结构蛋白组装产生病毒的衣壳结构。病毒衣壳蛋白是诱导产生中和抗体的主要免疫原，而结构蛋白与非结构蛋白均含有诱导细胞免疫的T细胞抗原表位。

早期通过单抗与免疫逃逸突变株的序列分析研究表明，在O型FMDV(O1BFS)至少存在5个功能独立的中和性抗原表位，组成抗原位点的区段主要包括VP1的G-H环以及其C端氨基酸，VP2上的31，70～73，75和77位氨基酸，VP1的B-C环上的43和44位点氨基酸；VP3上的58位氨基酸，VP1149位氨基酸(Crowther et al.，1993)等参与构成五个中和表位。这5个中和表位除了位点1为线性表位外，其余均为构象表位。利用合成肽免疫实验动物和牛的试验似乎证明位点1是最优势的抗原表位，但是有的试验结果显示疫苗免疫后针对位点2的抗体应答水平高于位点1(Samuel，1997)；其中针对G-H环位点的免疫显然是最重要的，因为不同血清型病毒，在G-H环附近的变异幅度最大，而且G-H环是病毒结合细胞受体的部位(Grubman and Baxt，2004)。T细胞表位对于诱导产生更高水平的中和抗体、尽早的清除病毒具有重要的作用，Cooke and Westover(2008)综合分析了不同血清型病毒抗原位点区域的差异，结果显示B-细胞与T-细胞抗原位点区域显示出很明显的血清型特征，已经发现在FMDV的结构蛋白以及非结构蛋白3A与3D上均存在T-细胞表位，有些T-细胞表位在血清型间比较保守，有些在毒株之间差异较大；其中VP4，VP1，3A，3D蛋白中均含有保守的T细胞表位，这些表位可能更易被宿主细胞表达的MHC分子识别，因而在分子疫苗设计中受到更多的关注。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种T细胞免疫原基因TI及其在口蹄疫蛋白亚单位疫苗和灭活疫苗中应用。

一种T细胞免疫原基因TI，其具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列。

进一步的，其具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列。

T细胞免疫原基因TI在口蹄疫蛋白亚单位疫苗和灭活疫苗中应用。

结果显示，与灭活疫苗或OA-VP1单独免疫组相比，添加TI抗原后灭活疫苗或OA-VP1免疫组小鼠均能产生高水平的特异性中和抗体(P＜0.5)；且CD4+T细胞数量显著增多(P＜0.01)，IFN-γ产生水平显著升高(P＜0.01)。说明TI抗原具有很好的诱导特异性体液与细胞免疫应答的作用，是一种很好的免疫增效剂，可作为口蹄疫蛋白亚单位疫苗和灭活疫苗中的一种有效成份，以提高疫苗的免疫效果。

本发明设计并合成了包含两个通用T细胞表位与来自口蹄疫病毒结构蛋白与非结构蛋白的多个细胞表位的串联表达基因，以期这种表达产物能够作为一种T细胞免疫原，用于蛋白亚单位疫苗和灭活疫苗，提高疫苗免疫后保护性中和抗体的水平和免疫持续期。

在本发明中，设计并串联表达了O和Asia 1两个型的VP1结构蛋白，用作蛋白亚单位疫苗的雏形来验证所表达T细胞免疫原的免疫增效作用。在小鼠体内的初步免疫试验结果表明，所表达的T细胞免疫原具有很好的免疫增效作用，有望用于发明口蹄疫蛋白亚单位疫苗或作为灭活疫苗中的免疫增效成份，来提高传统疫苗的免疫效果。本发明也为口蹄疫疫苗发明提供了一种新的思路。

附图说明

图1为表达蛋白TI的SDS-PAGE检测.M为蛋白分子质量标准，1为未诱导TI对照，2为诱导后TI表达产物，3为TI诱导表达培养上清，4为TI诱导表达产物的沉淀，5和6为纯化后的TI表达产物；