[发明专利]一种基因突变的检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因检测领域，特别提供了一种基因突变的检测方法。

背景技术

人体癌基因或抑癌基因的突变常常是肿瘤发生的早期事件，检测它们的突变情况，可以早期发现肿瘤，因此有着十分重要的临床意义。目前对基因突变的检测，常见有测序法；基因芯片杂交法；PCR-RFLP方法；PCR扩增产物毛细管电泳分析法；PCR高分辨熔解曲线分析技术；PCR荧光定量探针法；等位基因特异引物PCR扩增法等，这些方法都能不同程度的检测出基因突变情况，但它们的一个共同缺点是仅仅对突变体的定性分析，缺乏对突变体的精确定量。除此之外，这些方法或多或少还存在仪器价格高，操作难度大，存在一定假阴性和假阳性，检测成本高，临床普及程度低，不能同时大规模检测临床标本等缺点。如：直接测序法是突变分析的金标准，能发现已知和未知突变位点，但每个位点均需PCR扩增，然后测序，成本较高、工作量大、周期长、价格昂贵、不适合大样本分析；普通PCR-RFLP方法技术简便，价格便宜，适宜少量样本的实验室检测，但RFLP仅能检测有酶切位点的突变，无酶切位点不能检测，费时费力；芯片技术与传统的仪器检测方法相比具有高通量、微型化、自动化、防污染等特点，适用于全基因组突变扫描，不适宜单个基因的突变位点检测，且精度低，价格昂贵。PCR高分辨熔解曲线分析技术，能高通量检测基因的突变情况，试剂成本较低，但因其荧光信号来自染料，特异性受到影响，而且检测仪器是升级版的荧光PCR仪，价格高昂，普及受限；Taqman探针法适合已知突变位点，常常需要两条探针，并必须对探针序列和反应条件进行优化，不然有假阳性的发生；等位基因特异引物PCR扩增法，根据突变位点设计3'末端与突变位点碱基互补或错配的特异PCR引物，通过凝胶电泳或荧光信号等方法检测PCR扩增产物的有或无，从而检测基因型中的突变。该方法最关键的是设计与3'末端突变位点碱基互补或错配的两条特异引物，引物设计不好，将导致高背景的交叉扩增，若对SNP分析尚能接受，但对病人基因的突变体检测，就是大忌，不然会导致较高的假阳性。

目前对基因突变的检测都离不开PCR技术。简单的说，PCR就是利用DNA聚合酶对特定基因做体外的大量合成，通过DNA聚合酶特异性的复制，可以将一段基因放大为原来的一百亿至一千亿倍，从而易于进一步的分析。PCR反应必须具备的条件为：复制的DNA模板、特异的一对引物、DNA聚合酶、合成的原料及反应需要的缓冲体系。PCR由变性、退火、延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③ 引物的延伸：DNA模板--引物结合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需 2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因复制到成百上千亿倍。

现有技术方案中，PCR荧光Taqman探针法和等位基因特异引物PCR扩增法与本发明最为相近。PCR荧光Taqman探针法与常规PCR比较，多加入了一个特异性的荧光探针，该探针两端分别标记一个荧光报告基团和一个荧光淬灭基团，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，PCR仪检测不到荧光信号； PCR扩增时（在延伸阶段），Taq 酶的 5' － 3' 切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条 DNA 链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与 PCR 产物形成完全同步，这也是定量的基础所在。由于多加入了一条特异性探针，使得其扩增特异性大幅度提高，保证了检测的可靠性，为临床应用打开了方便之门。此外荧光Taqman探针法需要荧光PCR仪，全封闭检测，无需PCR后处理，有效杜绝了PCR产物导致的假阳性问题。

PCR荧光Taqman探针法检测基因突变，需分别设计两条探针，一条同突变体完全互补，一条同正常序列完全互补，其原理是根据Taqman探针在互补序列上有碱基错配时，在确定的退火温度下，同碱基序列不能很好结合，易于脱落，故不能检测到信号，从而做到突变型探针检测突变点，野生型探针检测正常序列，反之则不能。