[发明专利]一种抗鳗弧菌和迟钝爱德华氏菌的多效价活疫苗、相关表达载体及应用

说明书

技术领域

本发明涉及疫苗技术领域，更具体地，涉及多效价活疫苗技术领域，特别是指一种抗鳗弧菌和迟钝爱德华氏菌的多效价活疫苗、相关表达载体及应用。

背景技术

中国是水产养殖业大国，但随着高密度大规模养殖技术的发展，病害问题日益突出，对水产养殖业造成了巨大的威胁。据初步统计，目前危害我国水产养殖生物的疾病已达400～500种，全国每年水产养殖发病率达50％以上，损失率为20％左右。鱼类疾病达200多种。其中，弧菌病和爱德华氏菌病是在水产养殖中经常爆发的两大类疾病，致死率极高。

弧菌病是最早发现的鱼类细菌性疾病之一。鳗弧菌(Vibrio anguillarum)是水产养殖中常见的一类弧菌。它多在高盐度的水体中流行，分布区域几乎为世界性的，其发生没有宿主的种属选择性差异，也无具体的季节和时间上的区分，其流行适宜温度为25～32℃，超过28℃时流行极为迅速，几日之内即可造成养殖动物的大量死亡，严重威胁经济鱼类的养殖。

迟钝爱德华氏菌通常被分离于冷血动物肠道及其他环境尤其是淡水中，在温血动物和人中也可被分离到。迟钝爱德华氏菌主要对鳗鲡、鲇鱼和其他动物致病，并且能感染人类，引起疾病多表现为腹部膨胀，体表皮肤有不同程度的出血性溃烂。在世界不少国家和地区均有由该菌引起水产养殖动物的病害发生及流行，并且造成得损失严重。

长期以来，人们使用药物治疗的方法来对抗水产病害。但是药物在鱼体内的残留，产生耐药性病原体；导致水体污染并破坏正常的生态环境等不良后果使人们意识到药物治疗的不足之处。而疫苗具有针对性强，抗病周期长，可终身免疫，防治主动等特点，因此成为了世界水产养殖行业中研究和开发的主要前沿和应用领域。其中减毒活疫苗更以其给药方便，免疫保护力高，成本低廉为人们所广泛关注。

微生物表面展示技术是利用基因重组方法把靶蛋白(外源肽段或蛋白质结构域)基 因序列与特定的载体蛋白基因序列(又叫定位序列)融合后导人微生物宿主细胞，从而使靶蛋白表达并定位于微生物细胞表面。用这一技术设计疫苗可使表达的抗原充分展示在微生物的表面，其在免疫递呈方面可能更为有效，为发展高效安全的活疫苗开拓了更大的空间。利用这一技术在大肠杆菌等细菌的疫苗开发中已得到了成功应用(Stathopoulos C，et al.Characterization of Escherichia coli expressing anLpp-OmpA(46-159)-PhoA fusion protein localized in the outer membrane.Appl.Microbiol.Biotechnol.1996(45)，112-119)。在病原菌中展示外源抗原蛋白更可能起到多效价的作用。

在水产养殖的环境中，鱼类易同时受到多种病原菌的侵害。因此，研究能同时抵抗多种病原菌的疫苗十分经济实用。目前，尚未见以鳗弧菌和迟钝爱德华氏菌为主要防治对象的商品化多效价减毒活菌疫苗。

发明内容

本发明的主要目的就是针对以上存在的问题与不足，提供一种抗鳗弧菌和迟钝爱德华氏菌的多效价活疫苗、相关表达载体及应用，该多效价活疫苗设计独特巧妙，能同时抗鳗弧菌和迟钝爱德华氏菌，与传统疫苗比具有免疫保护效果更好的特点，使用简便，安全，费用低廉，为预防养殖鱼类的疾病提供一种安全，有效，经济的方式，有实际的商业开发应用价值，适于大规模推广应用。

在本发明的第一方面，提供了一种重组表达载体，其特点是，包括表达载体和整合在所述表达载体上的外源核苷酸序列，所述外源核苷酸序列编码丁香假单胞菌的冰核蛋白外膜定位元件和迟钝爱德华氏菌的3-磷酸甘油脱氢酶的融合蛋白，其中所述冰核蛋白外膜定位元件用于介导所述3-磷酸甘油脱氢酶的外膜定位。

所述迟钝爱德华氏菌可以选择任意的迟钝爱德华氏菌。较佳地，所述迟钝爱德华氏菌是迟钝爱德华氏菌EIB202，保藏编号为：CCTCC NO：M 208068。

所述丁香假单胞菌可以选择任意的丁香假单胞菌。较佳地，所述丁香假单胞菌是丁香假单胞菌丁香致病变种ICMP3023。

所述表达载体可以选择任何合适的表达载体。较佳地，所述表达载体为pUC18质粒。

所述冰核蛋白外膜定位元件可以是任何丁香假单胞菌的冰核蛋白外膜定位元件，所述3-磷酸甘油脱氢酶可以是任何迟钝爱德华氏菌的3-磷酸甘油脱氢酶。较佳地，所述冰核 蛋白外膜定位元件的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示；所述3-磷酸甘油脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。