[发明专利]一种鱼过敏原标准物的制备方法无效
| 申请号： | 201010597749.0 | 申请日： | 2010-12-21 |
| 公开（公告）号： | CN102128738A | 公开（公告）日： | 2011-07-20 |
| 发明（设计）人： | 匡华;胥传来;邓小芳;马文蔚;勇倩倩;宋姗姗;王利兵 | 申请（专利权）人： | 江南大学 |
| 主分类号： | G01N1/28 | 分类号： | G01N1/28 |
| 代理公司： | 无锡市大为专利商标事务所 32104 | 代理人： | 时旭丹;刘品超 |
| 地址： | 214122 江苏省无锡市*** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 过敏原 标准 制备 方法 | ||
1.一种鱼过敏原标准物的制备方法，其特征在于制备步骤为：
（1）脱脂
鱼肉捣碎均质后，用60～90℃石油醚脱脂，按鱼肉质量︰石油醚体积比W/V为1︰10，在低于60℃下进行搅拌萃取12h，4℃ 6000r/min离心15min，弃上清，沉淀置于通风橱使石油醚挥发，得脱脂鱼肉；
（2）浸提
将脱脂鱼肉溶解于4℃预冷的0.05mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液中，鱼肉质量︰磷酸盐缓冲液体积比W/V为1︰20，4℃磁力搅拌4h，4℃ 7000r/min离心20min，收集上清，得鱼蛋白浸提液；
（3）加热
将鱼蛋白浸提液加热但不沸腾，加热30min后，4℃ 7000r/min离心20min，收集上清；去除了不耐热杂蛋白，得耐热鱼蛋白浸提液；
（4）饱和硫酸铵分级沉淀
在所得耐热鱼蛋白浸提液中缓慢加入硫酸铵，边加边搅拌，直至溶液中硫酸铵饱和度达30%，4℃磁力搅拌1h、静置1h，4℃ 8000r/min离心20min，离心后的上清液中继续缓慢加入硫酸铵直至饱和度达50%，4℃磁力搅拌1h、静置1h，4℃ 8000r/min离心20min，收集沉淀，用0.05mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液复溶；
（5）凝胶过滤层析
将50%饱和度的蛋白组分装入透析袋，用0.05mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液于4℃透析48h，然后使用AKTA蛋白纯化系统进行凝胶过滤层析；条件：经Superdex 75 10/300 GL凝胶柱层析，以0.05mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液进行洗脱，流速0.4mL/min，2mL间隔自动收集，280nm紫外吸收监测，收集所需出峰样品，合并后于4℃超纯水透析24h；样品冷冻干燥后即为所制备的鱼过敏原蛋白标准品。
2.根据权利要求1所述的鱼过敏原标准物的制备方法，其特征在于，第（1）步中所用石油醚为60～90℃的石油醚，第（2）步中获得的鱼蛋白浸提液、第（3）步中获得的耐热鱼蛋白浸提液、第（4）步中获得的饱和硫酸铵分级沉淀组分、第（5）步中获得的凝胶过滤各峰组分都要进行变性聚丙烯酰胺电泳SDS-PAGE鉴定，电泳条件为：13.5%分离胶，5%浓缩胶，恒压100V，步骤（5）中冷冻干燥后获得的条带单一、相对分子量12kDa的蛋白质组分即为鱼过敏原标准物。
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