[发明专利]扩增常见致病型军团菌gyrB基因特异区引物及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及对米克戴德军团菌(Legionella micdadei)；博兹曼军团菌(Legionellabozemanii)；长滩军团菌(Legionella longbeachae)中gyrB基因(DNA gyrase B subunitgene，以下简称gyrB)的特异的核苷酸，特别是涉及对米克戴德军团菌、博兹曼军团菌、长滩军团菌中的gyrB特异的寡核苷酸及其应用。

背景技术

军团菌属于革兰阴性杆菌，是广泛存在于自然界的土壤和水环境中的一种条件致病菌。军团菌可以引发军团菌病，它是一种以呼吸道感染症状为主，伴全身中毒症状的细菌感染性疾病。自1976年首次在美国发现军团病以来，该病已呈现出世界性分布及病死率高的两大特点。军团菌有42个种，64个血清型，其中至少有22个种与人类疾病有关，与人类关系最密切的是嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)。在军团菌病例中，由嗜肺军团菌引发的病例占致病性军团菌引发病例的95％以上，其次为米克戴德军团菌、博兹曼军团菌、长滩军团菌。军团菌的生长与繁殖与环境因素密切相关，集中空调的冷却塔冷却水、冷凝水以及温泉水是军团菌在外界适宜的生存环境。当环境水中的军团菌繁殖到一定浓度，则会形成气溶胶进而感染人。宿主感染主要受其易感性和细菌毒力的影响，任何年龄均可发生，但中老年、基础免疫较差者、长途旅行者、吸烟者为高危人群，并以医院、宾馆、大型建筑工地等公共场所好发。

目前，细菌学培养法对疾病的诊断具有良好的敏感性和特异性，可以作为临床确诊和鉴定的标准。但是由于军团菌不易分离培养，而且种类又繁多。利用细菌学培养法对其进行鉴定需要价格昂贵的特殊培养基，而且细菌生长比较缓慢，要3～7d以上才能出结果，不利于临床的快速诊断，同时要求实验人员要有比较高的技术，费时费力。

近年来，越来越多的分子技术用于病原菌的鉴定、检测及病害诊断中，近年来，越来越多的分子技术用于病原菌的鉴定、检测及病害诊断中，包括特定基因序列分析、随机扩增长度多态性(RAPD)分析、核糖体DNA限制性片段长度多态性(RFLP)分析等。和传统检测技术相比，这些基于多聚酶链式反应(PCR)的分子检测技术，不需要经过病原菌的分离、纯培养等过程，而且具有快速、灵敏、特异性强等优点。

DNA链或染色体高级结构的变化是需要拓扑异构酶(Topoisomerase)参与的，包括I型和II型。DNA解螺旋酶gyrase是一种II型拓扑异构酶，最早是在E.coli中发现的，它由A、B两个亚基形式组成，gyrB就是编码B亚基的基因。和16S rRNA一样，gyrB和ISR均广泛存在于各种细菌细胞中，是细胞生命过程所必须的基因，但gyrB的进化速率却是16S rRNA的3～6倍，ISR的进化速率也比16S rRNA更快，可以作为细菌分子进化和系统分析的模式分子，近年来，人们已经开始使用它来区分、鉴定和检测许多用16S rRNA无能为力区分的细菌，相关报道及文献也越来越多。

聚合酶链式反应技术(Polymerase chain reaction，简称PCR技术)作为微生物检测的技术目前正在得到认同和推广，该技术相对于传统的方法有高通量、检测速度快、特异性强、灵敏度高等优点，只需对样品进行简单的预增菌或增菌过程，再通过离心及裂解制备细菌DNA模板，就可以在高特异性引物介导下的PCR过程中扩增目标序列，达到检测样品中是否含有待测的致病性微生物的目的。PCR的扩增过程仅需2个小时。这对检验检疫部门和临床检验无疑极大提高了工作速度和降低了工作成本。

发明内容

本发明的一个目的是提供扩增米克戴德军团菌、博兹曼军团菌、长滩军团菌中gyrB基因特异区的引物；

本发明的另一个目的是提供一种包括扩增米克戴德军团菌、博兹曼军团菌、长滩军团菌gyrB基因特异区的引物的PCR试剂盒，并利用该PCR试剂盒检测米克戴德军团菌、博兹曼军团菌、长滩军团菌的存在。

为实现上述目的，本发明通过以下技术方案予以实现：

扩增常见致病型军团菌gyrB基因特异区引物包括：米克戴德军团菌、博兹曼军团菌、长滩军团菌其中：

(1)对米克戴德军团菌的gyrB的特异核苷酸，所述核苷酸包含：

a)SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列或者其互补DNA序列；

b)上述a)中缺失、替换或插入一个或多个碱基、仍具有所述核苷酸功能的核苷酸序列。